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      花生衣總黃酮純化工藝研究

      2014-08-09 08:45:18朱麗紅柳小莉唐志書郭東艷
      吉林中醫(yī)藥 2014年9期
      關(guān)鍵詞:定容大孔藥液

      白 甫,朱麗紅,柳小莉,唐志書,郭東艷

      (陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,陜西 咸陽(yáng) 712046)

      花生衣為豆科植物落花生(ArachishypogaeaL.)的種皮,味甘、微苦、性平,具有健脾和胃、養(yǎng)血止血、散瘀消腫之功。主要含有脂質(zhì)、鞣質(zhì)、甾醇、花生苷、花生衣色素、兒茶素等成分[1],其中主要色素成分為黃酮類化合物,另外還含有花色苷、黃酮、二氫黃酮等?,F(xiàn)代藥理研究表明,花生衣的95% 乙醇總提物對(duì)正常小鼠及凝血障礙小鼠均有明顯的止血作用[2]。此外花生衣還具有抗纖維蛋白溶解、促進(jìn)骨髓制造血小板、縮短出血時(shí)間、加強(qiáng)毛細(xì)血管的收縮、調(diào)整凝血因子缺陷等功能[3]。臨床觀察結(jié)果表明花生衣湯能提高化療周期患者的血紅蛋白[4]、顯著提高肝硬化患者的血小板數(shù)[5]及具有防止化療引起血小板降低的作用[6]。近年來廣泛用于胃、腸、肺、子宮等內(nèi)臟出血,及放化療引起的血小板減少癥等。但是查閱大量文獻(xiàn)資料發(fā)現(xiàn),有關(guān)花生衣總黃酮純化工藝研究較少,因此本文擬采用大孔樹脂純化法對(duì)花生衣總黃酮的純化工藝進(jìn)行優(yōu)化,為后期進(jìn)一步制劑開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

      1 實(shí)驗(yàn)材料

      1.1 材料 花生衣購(gòu)于西安盛興中藥飲片有限公司,經(jīng)陜西中醫(yī)學(xué)院王繼濤老師鑒定為豆科植物落花生(ArachishypogaeaL.)的種皮;蘆丁對(duì)照品(中國(guó)生物制品檢定所,批號(hào)100080-200707),水為雙蒸餾水,試劑均為分析純;D101型大孔樹脂、HPD300型大孔樹脂、HPD100型大孔樹脂、AB-8型大孔樹脂(西安藍(lán)曉科技有限公司)。

      1.2 儀器 WJN-50多功能真空濃縮機(jī)(韓國(guó)),L-520型離心機(jī)(湖南賽特湘儀離心機(jī)有限公司),RE-52-05旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠),SB3200DT-超聲波清洗機(jī)(寧波)。

      2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

      2.1 總黃酮含量測(cè)定

      2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取在105 ℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10.0 mg,置50 mL量瓶中,加20 mL甲醇,超聲處理溶解,再用甲醇定容至刻度,搖勻,即得對(duì)照品溶液(0.20 mg/mL),放入冰箱備用。

      2.1.2 供試品溶液的制備 精密移取樣品液1 mL至50 mL量瓶中,加50%甲醇至刻度。精密吸取0.5 mL至25 mL量瓶中,加50%甲醇定容至刻度,搖勻,即得。

      2.1.3 總黃酮的最大吸收波長(zhǎng)的確定 分別對(duì)對(duì)照品溶液和供試品溶液進(jìn)行最大吸收波長(zhǎng)掃描,掃描范圍200~800 nm,結(jié)果均在510 nm處有強(qiáng)吸收峰。

      2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取對(duì)照品溶液2,3,4,5,6,7 mL,分別置25 mL量瓶中,各加水至6.0 mL,加5%亞硝酸鈉溶液1 mL,混勻,放置6 min,加10%硝酸鋁溶液1 mL,搖勻,放置6 min,加氫氧化鈉試液10 mL,再加水至刻度,搖勻,放置15 min,以相應(yīng)的試劑為空白,參照紫外-可見分光光度法(附錄ⅤA)在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo)(Y),濃度為橫坐標(biāo)(X),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 得回歸方程Y=11.339X-0.035,R2=0.999 7,結(jié)果表明蘆丁在0.016~0.056 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

      2.1.5 樣品中總黃酮含量測(cè)定 精密吸取供試品溶液1 mL,加水至6.0 mL,按2.1.4項(xiàng)下加5%亞硝酸鈉溶液1 mL起,至在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,記錄吸光度,計(jì)算總黃酮含量。

      2.2 樹脂型號(hào)的篩選

      2.2.1 母液的制備 稱取花生衣1 kg,加15倍量40%乙醇提取3次,每次30 min,濾過合并提取液,濃縮,回收乙醇至無(wú)醇味,加蒸餾水定容至2 000 mL,備用。

      2.2.2 樣品溶液的制備 取母液100 mL,加蒸餾水定容至250 mL,制成濃度為0.2 g/mL樣品。

      2.2.3 大孔吸附樹脂的預(yù)處理 用95%的乙醇浸泡24 h,蒸餾水洗至無(wú)醇味,備用。

      2.2.4 靜態(tài)吸附 將經(jīng)過預(yù)處理的4種大孔樹脂(D101、HPD100、HPD300、AB-8)去除表面水后,各取3 g,分別置于具塞錐形瓶中,再分別移取0.2 g/mL的樣品溶液50 mL加入裝有樹脂的具塞錐形瓶中,振搖8 h,靜置16 h,過濾,得殘留液。測(cè)定總黃酮含量A1。樹脂加入50%的乙醇50 mL,振搖8 h,靜置16 h,過濾,得到洗脫液,測(cè)定總黃酮含量A2。

      2.2.5 液殘留液及洗脫液中總黃酮的測(cè)定 母液中總黃酮的測(cè)定:取1 mL樣品溶液,用甲醇定容至25 mL,取出0.4 mL,加入顯色劑,定容至25 mL。測(cè)定母液中的總黃酮含量A3,結(jié)果見表1。

      未被吸附的殘留液中與洗脫液中總黃酮含量的測(cè)定:精密吸取殘留液與洗脫液各1 mL,用甲醇定容至25 mL,取出0.8 mL加顯色劑定容至25 mL。測(cè)定其殘留液中總黃酮含量A1,洗脫液中總黃酮含量A2,結(jié)果見表1。

      吸附率=[(母液含量A3(mg)-殘留液中總黃酮含量A1(mg))/母液含量A3(mg)]×100%

      解析率=[40%乙醇洗脫下的含量A2/(母液含量A3(mg)-殘留液中含量A1(mg))]×100%

      表1 靜態(tài)吸附考察結(jié)果

      結(jié)果表明:AB-8型大孔樹脂的吸附量、解吸量低于其他3種型號(hào)樹脂,D101的吸附率及解吸率較大,故選擇D101樹脂。

      2.3 樹脂純化條件的考察[7-8]

      2.3.1 徑高比的選擇 分別稱取預(yù)處理過的D101大孔樹脂2.4,4.8,7.2,9.6 g,使徑高比分別為1∶5,1∶10,1∶15,1∶20。樹脂生藥比為1∶1。分別取適量的樣品溶液稀釋至濃度為0.1/mL,加于D101樹脂柱上,以3 BV/h的流速進(jìn)行吸附,先以4 BV水洗脫后,再用4BV 70%乙醇洗脫,收集洗脫液,測(cè)定水洗液和醇洗液中總黃酮的含量,計(jì)算吸附率及洗脫率。結(jié)果當(dāng)徑高比為1∶15時(shí),花生衣的吸附率和洗脫率均最大,因此,確定樹脂柱的徑高比為1:15。

      2.3.2 上樣藥液濃度的選擇 稱取預(yù)處理過的D101大孔樹脂4份,每份7.2 g,使徑高比為1∶15。樹脂生藥比為1∶1,分別取適量的樣品溶液,將樣品溶液分別稀釋為含生藥0.1,0.2,0.3,0.4 g/mL,(原本考察的濃度為0.2,0.4,0.6,0.8 g/mL,但由于濃度到0.4 g/mL時(shí)。柱子有些堵,所以將濃度范圍定為0.1,0.2,0.3,0.4 g/mL),加于D101樹脂柱上,以3 BV/h的流速進(jìn)行吸附后,先以4 BV/h水洗脫后,再用4 BV/h 70%乙醇洗脫,收集洗脫液至,計(jì)算吸附率及洗脫率。結(jié)果見表2。

      表2 上樣藥液濃度的考察結(jié)果

      在從表中可以看出上樣藥液濃度為0.1 g/mL時(shí),花生衣中總黃酮的吸附率和洗脫率均最大,因此,確定上樣液的藥液濃度為0.1 g/mL。

      2.3.3 上樣藥液流速的考察 稱取D101樹脂7 g 4份,分別裝柱,徑高比為1∶15,取0.1 g/mL的藥液50 mL 4份。將4份樣品分別按照0.5,1,2,3 BV/h的流速上樣,統(tǒng)一按照50 mL水洗量,2 BV/h水洗流速進(jìn)行水洗除雜,70%乙醇洗脫至鹽酸鎂粉反應(yīng)無(wú)色。分別收集洗脫,取1 mL用甲醇定容至25 mL,精密量取0.8 mL,加顯色劑定容至25 mL。結(jié)果見表3。

      表3 上樣藥液流速考察結(jié)果

      結(jié)果表明:上樣流速對(duì)有效成分的吸附有顯著的影響,在2 BV/h的條件下有效成分含量最大,故確定上樣流速為2 BV/h。

      2.3.4 水洗大孔樹脂的考察 取已經(jīng)過預(yù)處理的大孔樹脂7.2 g裝柱(1.1 cm×15 cm,V=3.14×(1.1/2)2×15=14.25),取上樣藥液72 mL(0.1 g/mL)藥液上樣后靜置2 h,以流速為2 BV/h的水除去水溶性雜質(zhì)。以15 mL為單位收集洗脫液,洗至無(wú)顏色。以鹽酸鎂粉反應(yīng)陰性作為水洗終點(diǎn),最終確定洗脫用水用量約3 BV。

      2.3.5 洗脫劑濃度的確定 取已經(jīng)過預(yù)處理的大孔樹脂裝柱(1.1 cm×15 cm,V=3.14×(1.1/2)2×15=14.25),取上樣藥液72 mL(0.1 g/mL)。藥液上樣后靜置2 h,用3 BV水洗去雜質(zhì)后,依次用10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液各3 BV進(jìn)行梯度解吸,分段收集解吸液。測(cè)定并計(jì)算解吸液中黃酮的含量,繪制解吸曲線,結(jié)果見圖1。

      圖1 洗脫劑濃度考察結(jié)果

      由圖可以看出,黃酮在60%時(shí)基本解析完畢,但由于在解吸的過程中乙醇會(huì)揮發(fā),所以選擇70%的乙醇為洗脫劑。

      2.3.6 洗脫劑用量的考察 取已經(jīng)過預(yù)處理的大孔樹脂裝柱(1.1 cm×15 cm,V=3.14×(1.1/2)2×15=14.25),取上樣藥液72 mL(0.1 g/mL生藥)藥液上樣后靜置2 h,用3 BV水洗去雜質(zhì)后,用70%乙醇進(jìn)行洗脫,每1 BV收集1份,測(cè)定洗脫液中總黃酮的含量,繪制解析曲線。結(jié)果見圖2。

      圖2 洗脫液用量考察試驗(yàn)結(jié)果曲線

      結(jié)果表明:當(dāng)洗脫劑用量達(dá)到3 BV時(shí),洗脫液中的黃酮含量已很低。所以選擇洗脫劑用量為3 BV。

      2.4 花生衣大孔樹脂的工藝參數(shù)驗(yàn)證 按照優(yōu)選的工藝條件,選用D101型大孔樹脂,上樣藥液濃度為0.1 g/mL,上樣速度為2 BV/h,樹脂徑高比為1∶15,洗脫時(shí)先用3 BV水洗,再用3 BV 70%乙醇洗脫,收集洗脫液,干燥,計(jì)算總黃酮含量。結(jié)果總黃酮平均含量為66.12%(n=3)。表明該純化工藝穩(wěn)定、合理、可行。

      3 結(jié)論

      大孔樹脂吸附法是近年來中藥及天然藥物純化工藝中應(yīng)用較為廣泛的一種方法。由于其價(jià)格便宜,可重復(fù)使用,且所得到的的純化物色澤較淺,吸濕性降低,特備適宜于中藥提取液的分離純化。故本文采用其對(duì)花生衣的總黃酮進(jìn)行純化精制,為后期制劑成型奠定基礎(chǔ)。

      本文通過建立紫外-可見分光光度法對(duì)花生衣總黃酮進(jìn)行含量測(cè)定,通過D101型大孔吸附樹脂對(duì)總黃酮分離富集條件進(jìn)行了優(yōu)化優(yōu)化,確定了其分離富集條件。經(jīng)純化后花生衣總黃酮純度達(dá)到66.12%,分離效果良好該工藝具有操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),具有較好的推廣應(yīng)用。

      [1]張秀堯,凌羅慶,戴榮興.花生衣的化學(xué)成分研究[J].中國(guó)中藥雜志,1990,6(16):36-37.

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