周春剛，張志斌，陸 曙

(無錫中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)藥研究所，江蘇無錫214061)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)中醫(yī)病因病機(jī)復(fù)雜，但以肝、脾、腎虧虛為本，以火毒與血瘀、痰濕等濁邪為標(biāo)，“熱”“濁”“腎虛”是AS的基本病理因素，“清熱”“泄?jié)帷薄把a(bǔ)腎”成為治療動(dòng)脈粥樣硬化的主要治則［1］。筆者在臨床根據(jù)此治則處方用藥取得良好效果［2-3］，經(jīng)過多年積累，常以自擬“連豆清脈方”為基礎(chǔ)方加減，藥用:連翹、野料豆、赤芍、萊菔子、牡丹皮等。動(dòng)脈粥樣硬化的早期表現(xiàn)內(nèi)皮損傷、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、血管內(nèi)皮功能紊亂，可能影響血壓調(diào)節(jié)，導(dǎo)致平滑肌增生、移位、血液凝固，是血管損傷的重要機(jī)制。很多致動(dòng)脈硬化因子包括氧化低密度脂蛋白、ANGⅡ、氧化應(yīng)激均能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［4］，而中醫(yī)藥治療動(dòng)脈粥樣硬化，對(duì)防治血管內(nèi)皮功能紊亂的作用及機(jī)制研究已經(jīng)取得一定的進(jìn)展［5］。為探討連豆清脈方防治動(dòng)脈粥樣硬化作用機(jī)制，筆者通過建立ANGⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型，探討連豆清脈方對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體損傷途徑的保護(hù)作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株 大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞株(RAOEC R304-05)，從上海拜力生物科技有限公司購(gòu)買。

1.2 藥物和試劑 DMEM高糖(GIBCO)，10%FBS(GIBCO)，0.25% 胰酶(GIBCO)，Angiotensin Ⅱ5mg(美國(guó)ENZO)，Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó) BD)，SYBR PrimeScript RT-PCR KitⅡ試劑盒(TAKARA DRR083S)，線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)(KGA-601-604)。

1.3 主要儀器 流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD)，LightCycler480 PCR儀(德國(guó)ROCHE)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)NUAIRE)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 連豆清脈方水提液制備 連豆清脈方組成:野料豆 15 g，連翹 10 g，黃連 3 g，知母 10 g，赤芍 10 g，牡丹皮10 g，萊菔子10 g。水提液制備采用水提醇沉法，采用 DMEM高糖培養(yǎng)基定容，再以孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，分裝，使其含生藥量為50 mg/mL(原液)，－70℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 RAOEC細(xì)胞培養(yǎng)和處理 RAOEC細(xì)胞株在含有10%新生牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAOEC細(xì)胞，每孔接種8×104個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分組為未加ANGⅡ?qū)φ战M，ANGⅡ(10－7mol/L)組(模型建立時(shí)ANGⅡ最佳劑量)和500 μg/mL連豆清脈方干預(yù)組(預(yù)實(shí)驗(yàn)取最佳劑量)，均設(shè)復(fù)孔，每個(gè)實(shí)驗(yàn)需重復(fù)3～4次。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位 實(shí)驗(yàn)在加入10－7mol/L ANGⅡ和500 μg/mL的連豆清脈方后10 h收集細(xì)胞;用PBS洗滌細(xì)胞1次，收集不多于1×106的細(xì)胞;取500 μL JC-1工作液將細(xì)胞均勻懸浮，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育15 min;室溫離心收集細(xì)胞，用500 μL 1×染色結(jié)合液洗滌2次;吸取500 μL 1×Incubation Buffer重新懸浮細(xì)胞。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取1×106個(gè)細(xì)胞，1 mL 4%多聚甲醛(PFA)固定20 min，PBS洗2次，棄上清，沉淀細(xì)胞分2管，作為Annexin V和PI單陽(yáng)性對(duì)照以調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞用冷PBS洗2次，0.25%胰酶消化處理，Annexin V和PI標(biāo)記后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)［6］。

2.5 實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量檢測(cè)Bax/Bcl-2，caspase9/XIAP mRNA表達(dá) 管家基因β-actin作為內(nèi)參基因，β-actin上游引物序列:5'-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3'，下游引物序列:5'-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'。Bax上游引物序列:5'-TGCTGATGGCAACTTCAACT-3'，下游引物序列:5'-GTGAGGACTCCAGCCACAAA-3'。Bcl-2上游引物序列:5'-TGAAC-CGGCATCTGCACAC-3'，下游引物序列:5'-CGTCTTCAGAGACAGCCAGGAG-3'。caspase9上游引物序列:5'-AGCCAGATGCTGTCCCATAC-3'，下游引物序列:5'-CAGGAGACAAAACCTGGGAA-3'。XIAP 上 游引物序列:5'-TCTGGTGTGAGTTCTGATAGG-3'，下游引物序列:5'-TGGATACCACTTAGCATGCTG-3'。相對(duì)定量分析采用△△CT法，△△CT法是通過Light Cycler Relative Quantification(Version 1.0)軟件，假定目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增效率相同時(shí)，擴(kuò)增效率默認(rèn)為 2，標(biāo)準(zhǔn)化比值計(jì)算公式采用 2-△△CT法［7］。以未加ANGⅡ?qū)φ湛准?xì)胞作為校準(zhǔn)品(calibrator)，實(shí)驗(yàn)組mRNA水平與校準(zhǔn)品mRNA水平比較的相對(duì)比值作為定量值。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.5處理，數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，2組間差異統(tǒng)計(jì)性分析采用Students T-test，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)ANGⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡線粒體膜電位 結(jié)果顯示，未加ANGⅡ?qū)φ战M線粒體膜電位為(6.27±3.06)，10－7mol/L ANGⅡ誘導(dǎo)組線粒體膜電位顯著降低，為(0.55±0.17)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，500 μg連豆清脈方干預(yù)組線粒體膜電位(4.45±2.75)，與正常對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而與ANGⅡ誘導(dǎo)組比較則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，結(jié)果見表1。

3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)連豆清脈方干預(yù)ANGⅡ誘導(dǎo)RAOEC細(xì)胞凋亡 結(jié)果顯示10－7mol/L ANGⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞24 h凋亡率為30.37% ±10.91%，500 μg連豆清脈方組具有明顯的干預(yù)ANGⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用，24 h凋亡率為13.54% ±3.8%，與 ANGⅡ組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，結(jié)果見表1。

表1 連豆清脈方對(duì)ANGⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡線粒體膜電位和凋亡率的影響(珋±s，n=4)

表1 連豆清脈方對(duì)ANGⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡線粒體膜電位和凋亡率的影響(珋±s，n=4)

注:與ANGⅡ組比較，#P＜0.05

組 別 線粒體膜電位 凋亡率/%正常對(duì)照組 6.27 ±3.06 14.45 ± 4.43 ANGⅡ組 0.55 ±0.17 30.37 ±10.91連豆清脈方干預(yù)組 4.45 ±2.75# 13.54 ± 3.80#

3.3 RT-qPCR熒光相對(duì)定量 Bax/Bcl-2，caspase9/XIAP mRNA表達(dá)水平 與未加ANGⅡ的對(duì)照組比較，10－7mol/L ANGⅡ組Bax和caspase9 mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，分別為(1.27±0.145)和(1.75±0.37)，XIAP mRNA表達(dá)亦上調(diào)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Bcl-2 mRNA表達(dá)水平下調(diào)，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，500 μg連豆清脈方組與ANGⅡ組比較，Bax和 caspase9 mRNA表達(dá)水平下調(diào)，分別為(0.755±0.264)和(0.776±0.152)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而Bcl-2 mRNA表達(dá)水平上調(diào)，為(1.368±0.225)，與ANGⅡ組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。XIAP mRNA表達(dá)與ANGⅡ組表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，結(jié)果見表2。

表2 連豆清脈方組實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量Bax/Bcl-2，caspase9/XIAP mRNA表達(dá)(珋±s，n=4)

表2 連豆清脈方組實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量Bax/Bcl-2，caspase9/XIAP mRNA表達(dá)(珋±s，n=4)

注:與ANGⅡ組比較，#P＜0.05

Bax Bcl-2 caspase9 XIAP ANG Ⅱ組 1.270 ±0.145 0.882 ±0.098 1.750 ±0.370實(shí)驗(yàn)分組1.160 ±0.107 1.219 ±0.156連豆清脈方干預(yù)組 0.755 ±0.264# 1.368 ±0.225# 0.776 ±0.152#

4 討論

細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑非常復(fù)雜，當(dāng)前認(rèn)為至少有3條途徑參與凋亡發(fā)生，即死亡受體途徑，線粒體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑［8］。研究表明，ANGⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與ANGⅡ受體活化有關(guān)［9］，ANGⅡ引起線粒體細(xì)胞色素C釋放，形成凋亡小體，繼而procas pase 9活化，激活下游caspase 3、caspase 6和caspase 7，導(dǎo)致凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)［10］。前期筆者在對(duì)ANGⅡ誘導(dǎo)大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡模型中發(fā)現(xiàn)，其受體AT1R和AT2R均參與ANGⅡ誘導(dǎo)內(nèi)皮凋亡過程，死亡受體途徑和線粒體途徑相關(guān)分子Fas、caspase 8、Bax和caspase 9表達(dá)上調(diào)。臨床應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)連豆清脈方可以同時(shí)降低冠心病患者LDL-C濃度和動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)，并進(jìn)一步降低hs-CRP、外周血白細(xì)胞數(shù)，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎癥作用［11］。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，連豆清脈方干預(yù)后，能夠抑制ANGⅡ誘導(dǎo)大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡作用，連豆清脈方能夠穩(wěn)定線粒體膜電位，下調(diào)促凋亡蛋白Bax和caspase 9表達(dá)，上調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)，表明連豆清脈方可能通過線粒體途徑抑制ANGⅡ誘導(dǎo)大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。研究認(rèn)為，連豆清脈方的主要中藥成份連翹、黃連、知母、赤芍等能夠通過不同機(jī)制對(duì)抗細(xì)胞凋亡，連翹通過增加細(xì)胞內(nèi)CK活力和穩(wěn)定細(xì)胞線粒體跨膜電位而抑制缺血性損傷誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡［12］，黃連及其活性成分通過抗氧化、抗炎和拮抗鈣超載等作用最終減少細(xì)胞凋亡，減輕組織缺血再灌注損傷［13］，知母皂苷抑制巨噬細(xì)胞TNF2α和NO的產(chǎn)生，對(duì)活化巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡起保護(hù)作用［14］，赤芍總苷穩(wěn)定心肌細(xì)胞膜、清除自由基和抑制心肌細(xì)胞早期凋亡［15］。連豆清脈方劑組成復(fù)雜，可能通過其抗氧化活性，降低線粒體氧化損傷，繼而影響凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，抑制ANGⅡ誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

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