王 微,馬立斌,尚云龍,董燕飛,李洪禹,葛學(xué)萍,孟令玉,韓澤華,王冰梅*

(1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室，長(zhǎng)春 130117；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春 130117；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130117)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備益氣解毒中藥復(fù)方含藥血清，研究其體外抗小鼠肝癌H22細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠肝癌H-22細(xì)胞株,購(gòu)自吉林省腫瘤研究所。SD大鼠，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。益氣解毒方由我校附屬醫(yī)院臨床驗(yàn)方加減而成：黃芪、當(dāng)歸、丹參、鱉甲、菊花、半枝蓮等，經(jīng)過(guò)水煎醇沉處理，制成濃度1.25 g生藥/mL的藥液備用?；熽?yáng)性藥：5-氟尿嘧啶(5-FU)由上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(Fetal Serum Bovine，F(xiàn)BS)，Hyclone公司產(chǎn)品；RPMI-1640完全培養(yǎng)基干粉：美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-(2，5)-二苯基四氮唑溴鹽(噻唑藍(lán),MTT):美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide DMSO)：Amresco公司產(chǎn)品；臺(tái)盼藍(lán)，青霉素，鏈霉素。其他常規(guī)化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。二氧化碳培養(yǎng)箱，Heraeus Hera Cell-150型，德國(guó)；研究用倒置顯微鏡，OLIMPUS IX-70，日本；全自動(dòng)酶標(biāo)儀，Bio-Rad680型，美國(guó)；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠；低速離心機(jī)，上海飛鴿。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠肝癌H22細(xì)胞以臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)法顯微鏡下計(jì)數(shù)，加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×105/mL接種于培養(yǎng)瓶中。置二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)(5%CO2，37 ℃)中靜置培養(yǎng)，待培養(yǎng)液變?yōu)槌壬珪r(shí)更換培養(yǎng)基，以1 000 r/min速度離心5 min，棄上清，再以RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至數(shù)量較多時(shí)，離心后，分瓶培養(yǎng)，傳代。

2.2 大鼠含藥血清的制備 取健康大鼠10只，雌雄不限，體質(zhì)量180～220 g。每天禁食10～12 h后，按“人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表”[1]，人與大鼠的等效劑量比值56.0換算，每日應(yīng)以1.25 g生藥/mL的濃度按10 mL/kg體質(zhì)量的劑量灌胃給予中藥提取液益氣解毒方。采用血清藥理實(shí)驗(yàn)中的通法方案[2],給藥方式為每日分2次給藥，間隔10～12 h。連續(xù)灌胃給藥3 d后，于末次給藥后1 h，20%氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉，無(wú)菌條件下腹主動(dòng)脈采血，4 ℃靜置2 h，1 500 r/min離心15 min，10 min后取血清，56 ℃，30 min滅活，分裝，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹3]。 另取健康大鼠5只，連續(xù)3 d每日給予等量生理鹽水灌胃，于末次灌胃后1 h采血，處理同上，制備對(duì)照組血清，分裝，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 MTT法檢測(cè)益氣解毒方對(duì)體外培養(yǎng)小鼠肝癌H22細(xì)胞增殖的抑制作用 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)法鏡下計(jì)數(shù)，用RPIM-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，稀釋細(xì)胞濃度至5×105個(gè)/mL，取96孔板，每孔加入190 μL細(xì)胞。置37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)板中的細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和給藥組。陰性對(duì)照組加不含藥血清10 μL；陽(yáng)性對(duì)照組加50 μmol/L的5-FU 10 μL;給藥組分別加入2.5%、5%、10%、20%的含藥血清(均為10 μL)，各組各劑量均設(shè)8個(gè)平行孔。 加藥培養(yǎng)44 h后，取出培養(yǎng)板，在超凈臺(tái)內(nèi)每孔加入20 μL MTT溶液,放回培養(yǎng)箱，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。 取出培養(yǎng)板，小心吸出各孔培養(yǎng)液上清，加入DMSO 150 μL，置于酶標(biāo)儀中振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，以570 nm波長(zhǎng)測(cè)各孔吸光值，各平行孔的吸光值取平均值(A)，根據(jù)A值計(jì)算H22細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。

3 結(jié)果

3.1 益氣解毒方含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠肝癌H22細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài)的影響 于倒置顯微鏡下每日對(duì)體外培養(yǎng)H22細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，各濃度的益氣解毒方含藥血清均對(duì)H22細(xì)胞有抑制作用。培養(yǎng)24 h后，各組細(xì)胞飽滿圓潤(rùn)，大小均一，表面光滑，核分裂相增多，細(xì)胞折光性好，培養(yǎng)液較為清澈，極少見(jiàn)細(xì)胞碎片；繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，陰性對(duì)照組細(xì)胞增殖明顯，幾乎鋪滿整個(gè)培養(yǎng)孔，極少見(jiàn)細(xì)胞碎片。加藥培養(yǎng)48 h后，給藥組與對(duì)照組比較，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞大小不一，死亡細(xì)胞增多，細(xì)胞膜表面略顯粗糙，折光性差，胞漿內(nèi)顆粒增多、增粗，培養(yǎng)液中懸浮較多細(xì)胞碎片。

3.2 益氣解毒方含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)小鼠肝癌H22細(xì)胞增殖的抑制作用 見(jiàn)表1。

表1 益氣解毒方含藥血清加藥培養(yǎng)24、48 h后對(duì)H22細(xì)胞增殖的抑制作用(n=8)

注：與陰性對(duì)照組，###P<0.001，##P<0.01。

4 小結(jié)

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝癌的發(fā)病原因主要與機(jī)體的正虛邪實(shí)[4]、氣滯血瘀、濕毒凝聚有關(guān)[5]。故而臨床上多采用益氣扶正[6-8]、活血散結(jié)[9]的中藥復(fù)方進(jìn)行治療。

本研究以中醫(yī)理論為基礎(chǔ)[10]，根據(jù)臨床經(jīng)方配伍，采用補(bǔ)益類(lèi)藥物佐以清熱解毒、活血散結(jié)之中藥，確立了經(jīng)黃芪、當(dāng)歸、丹參、鱉甲、菊花、半枝蓮等中藥為主的益氣解毒方。通過(guò)血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，該中藥復(fù)方對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠肝癌H22細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用,且這種抑瘤作用呈現(xiàn)出時(shí)間、濃度依賴性，其體內(nèi)抗腫瘤作用效果及抗腫瘤作用機(jī)制有進(jìn)一步研究的意義。

[1]徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:1861.

[2]李儀奎,吳健宇.血清藥理實(shí)驗(yàn)中采血時(shí)間的通法方案[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),1999,15(6):569-570.

[3]崔曉蘭,周愛(ài)香,賀玉琢,等.中藥復(fù)方血清藥理研究方法學(xué)探討Ⅳ[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2000,6(2):23-25.

[4]李川,呂文良,何立麗,等.孫桂芝教授治療肝癌常用中藥探析[J].吉林中醫(yī)藥,2013,33(6):569-572.

[5]袁學(xué)文,陳毓杰,葉立新.中藥仙鶴復(fù)方水提取物對(duì)S180肉瘤和H22肝癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的抗腫瘤作用研究[J].臨床合理用藥,2013,6(8):7-8.

[6]楊欣,李涌健.健脾益氣法對(duì)原發(fā)性肝癌免疫微環(huán)境影響的研究[J].吉林中醫(yī)藥,2013,33(1):9-10.

[7]方瑜,楊柳青,陳光偉.扶正抗癌方對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].陜西中醫(yī),2013,34(9)1253-1255.

[8]應(yīng)險(xiǎn)峰.“三辨”治肝癌[J].中醫(yī)臨床研究,2012,18(4):18.

[9]姜子瑜,華海清,秦叔逵,等.復(fù)方苦參注射液對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖與細(xì)胞周期的影響[J].吉林中醫(yī)藥,2011,31(7):690-692.

[9]李川,呂文良,孫桂枝.孫桂芝教授益氣活血解毒散結(jié)法治療肝癌學(xué)術(shù)思想[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,28(6):1002-1003.