馬生軍，王文全，朱金芳，侯俊玲

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 100102；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所,北京 100193；4.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心,北京 100102)

錳(Mn)是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的微量元素之一，作為多種酶的活化劑和重要的氧化還原劑的研究還較薄弱，在已篩選的數(shù)量有限的編碼酶基因中，部分生物學(xué)功能已得到確認(rèn)[1]。近年來(lái)，利用T-DNA插入突變和酵母菌功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)在植物中鑒定了多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白部分參與錳的跨膜運(yùn)輸[2]。進(jìn)一步分析表明，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在細(xì)胞水平上參與錳向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和向不同細(xì)胞器(葉綠體和線粒體等)的釋放，以及活性離子在內(nèi)膜區(qū)域(液泡、高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)的屏蔽作用，而在整個(gè)植株水平上參與植物對(duì)錳的吸收、長(zhǎng)距離運(yùn)輸和在地上部的累積過(guò)程[3]。熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time quantitative PCR，Real-time PCR)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的核酸微量技術(shù)，它實(shí)現(xiàn)了RT-PCR反應(yīng)從定性到定量的飛躍。利用Real-time PCR手段分析不同濃度錳處理下甘草β-香樹(shù)脂醇合成酶(β-amyrin synthase,β-AS)基因的表達(dá)豐度，對(duì)于明確該基因的表達(dá)受錳調(diào)控的影響具有重要意義。

甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)是中藥中常用的大宗藥材之一，具有補(bǔ)脾益氣，祛痰止咳，調(diào)和諸藥等功效，其主要次生代謝產(chǎn)物甘草酸是經(jīng)過(guò)多個(gè)生物合成步驟才得以形成的，而每個(gè)步驟均受到酶的調(diào)控[4-5]。β-AS基因是甘草酸生物合成途徑中的重要基因,與甘草酸生物合成具有密切關(guān)系[6]。甘草酸是以異戊二烯為基本結(jié)構(gòu)單元構(gòu)建的三萜類化合物，β-AS催化2，3-氧化鯊烯環(huán)化成β-香樹(shù)酯醇，是控制形成甘草酸類化合物(齊墩果烷型)或是白樺酯酸類化合物(羽扇豆烷型)的分支點(diǎn)，是甘草酸生物合成的關(guān)鍵酶[5]。最新的研究表明根施一定濃度的錳能顯著增加甘草藥材中甘草酸含量[7]。因此，本文以β-AS基因作為研究對(duì)象，比較其在不同濃度錳處理下在甘草G.uralensis根部的表達(dá)情況，為揭示該基因?qū)Ω什菟岷康挠绊憴C(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步提高栽培甘草質(zhì)量、實(shí)現(xiàn)甘草資源的可持續(xù)利用提供理論支持。

1 材料

1.1 植物 以一年生甘草移栽苗為試驗(yàn)材料，該苗來(lái)自內(nèi)蒙古赤峰，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王文全教授鑒定為甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch。

1.2 試劑 TRIZOL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invtrogen公司；DNaseⅠ和RNase inhibitor購(gòu)自美國(guó)Fermentas(MBI)公司；DL DNA-2000 Marker，dNTP mixture (each 10 mM)，Oligo dT primer，5×M-MLV Buffer，M-MLV(Rnase H-)，LA Taq DNA聚合酶均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；Eva-green購(gòu)于美國(guó)Biotium公司;異丙醇、氯仿、乙醇等試劑均為分析純，購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司。

1.3 儀器 centrifuge(MICRO 17TR)離心機(jī)(韓國(guó)Hanil公司)；mixer vortex(Voltex-Genie2)漩渦混合器(美國(guó)SI公司)；system electrophoresis Mupid(Mupid 2plus)電泳槽(日本Takara公司)；image system(EUV-LDUV)凝膠成像系統(tǒng)(韓國(guó)Biotech公司)；ASP-2680超微量分光光度計(jì)(美國(guó)ACTGene公司)；2720型PCR儀(美國(guó)ABI公司)；Chromo4熒光定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；Freezer Big(DW-40L262)冰箱(青島海爾公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化公司)；2.5、10、100、200/1 000μL移液器(德國(guó)Eppendorf公司)；Balance(BT-214)天平(美國(guó)Denver公司)。

2 方法

2.1 植物材料的處理 試驗(yàn)在北京中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園內(nèi)進(jìn)行,2013年4月下旬將生長(zhǎng)狀況基本保持一致的一年生甘草苗移栽于花盆中,盆高35 cm，盆口直徑35 cm，盆底直徑25 cm，栽培基質(zhì)為蛭石∶珍珠巖∶河沙=5∶1∶1，每盆20株，然后將花盆埋入土中。每周向花盆中澆灌Hoagland營(yíng)養(yǎng)液以提供植物所需的養(yǎng)分，待植株生長(zhǎng)正常時(shí)，進(jìn)行不同濃度的錳處理試驗(yàn)，分別設(shè)置0(CK)，1.81，18.1，36.2和54.3 mg/L5個(gè)錳濃度，其中1.81 mg/L為Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液中錳濃度，并在此質(zhì)量濃度基礎(chǔ)上設(shè)置10倍，20倍和30倍的錳水平以及未施錳的對(duì)照(CK)處理，每樣品重復(fù)4次。處理90 d后取樣。

2.2 甘草根總RNA的提取 稱取0.2 g甘草主根于液氮中研磨，參照Invitrogen公司TRIZOL試劑盒說(shuō)明提取甘草總RNA，通過(guò)1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量并拍照，同時(shí)利用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)各處理OD值。

2.3 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈 DNaseⅠ處理去除基因組DNA污染，逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程如下：首先在200 μL離心管中配制如下(體系一)：模板RNA 0.5 μg，10 mmol/LdNTP Mixture 1.0 μL，50 μmol/LOligo dT 1.0 μL，補(bǔ)足RNase free dH2O總量至10 μL，65 ℃反應(yīng)5 min，置于冰上2 min，瞬時(shí)離心。然后在以上體系中加入總量為20 μL的如下混合反應(yīng)液(體系二):模板RNA(引物的變性溶液)10.0 μL，5×M-MLVBuffer 4.0 μL，200 U/μL M-MLV(RNase H-)1.0 μL，40 U/μL RNase inhibitor 0.5 μL，RNase free dH2O 4.5 μL。30 ℃保溫10 min。42 ℃保溫1 h，70 ℃ 15 min，之后立即置于冰上冷卻。產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆没蛄⒓催M(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2.4 引物的設(shè)計(jì)與合成 參考相關(guān)內(nèi)參基因及甘草文獻(xiàn)，選擇18S rRNA作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，用于甘草的定量檢測(cè)。內(nèi)參18S基因的引物和待檢測(cè)基因β-AS擴(kuò)增片段大小均在300 bp以內(nèi)，可以很好的起到內(nèi)參的作用。

依據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上提供的甘草18S和β-AS基因序列，找出序列保守區(qū)，用primer premier 5.0 軟件分段設(shè)計(jì)引物(表1)，引物由北京中美泰和生物工程有限公司合成。

表1 18S和β-AS基因的PCR擴(kuò)增引物

2.5 實(shí)時(shí)定量PCR(Real-timePCR)擴(kuò)增

2.5.1 PCR反應(yīng)體系 20.0 μL反應(yīng)體系中，內(nèi)含10×PCR buffer(含鎂離子)2.0 μL;2.5 mmol/LdNTP 3.2 μL；5 μmol/LForward primer 1.0 μL；5 μmol/LReverse primer 1.0 μL；1 U/LLA TaqDNA聚合酶0.2 μL；cDNA模板5.0 μL；ddH2O 7.6 μL。

2.5.2 PCR反應(yīng)程序 在PCR儀中，95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s，40個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物于4 ℃保存?zhèn)溆没蛄⒓催M(jìn)行PCR凝膠電泳。

2.5.3 Real-time PCR擴(kuò)增20.0 μL反應(yīng)體系中，內(nèi)含10×PCR buffer(含鎂離子)2.0 μL；2.5 mmol/LdNTP 3.2 μL；5 μmol/LForward primer 1.0 μL；5 μmol/LReverse primer 1.0 μL；1 U/LLA TaqDNA聚合酶 0.2 μL；cDNA模板5.0 μL；1×1.25 μL；ddH2O 6.05 μL。在Real-timePCR儀中，95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s,65 ℃退火30 s，40個(gè)循環(huán)。

2.6 瓊脂糖凝膠電泳 反應(yīng)結(jié)束后取4.0 μL PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)一步檢測(cè)PCR擴(kuò)增情況。120 V電壓，電泳20～30 min。凝膠成像系統(tǒng)下查看，并拍照。

2.7 β-AS基因的Real time PCR分析 將Real-time PCR儀所得的樣品Ct值，利用2-△△Ct方法轉(zhuǎn)化為基因相對(duì)表達(dá)量值。應(yīng)用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入及表的繪制，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與One-way ANOVA方差分析，并用Duncan檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同濃度錳處理甘草總RNA提取 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)不同濃度錳處理甘草總RNA(圖1)：甘草根總RNA條帶清晰完整, 亮度均勻，點(diǎn)樣孔周?chē)鸁o(wú)污染, 并且沒(méi)有明顯拖尾現(xiàn)象，分光光度計(jì)檢測(cè)，D260/D280均在1.8～2.0之間，D260/D230大于2.0，說(shuō)明采用該方法提取的RNA純度較高、質(zhì)量較好,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同錳處理甘草總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

3.2 擴(kuò)增體系的驗(yàn)證 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，均產(chǎn)生與預(yù)期大小一致的擴(kuò)增條帶，無(wú)引物二聚體及非特異性擴(kuò)增(圖2)。經(jīng)Real-time PCR驗(yàn)證2個(gè)基因的熔解曲線均顯示明顯的單一峰，說(shuō)明所用引物的特異性較好(圖3)。

3.3 不同濃度錳處理甘草18S和β-AS基因Ct值比較 以不同濃度錳處理的盆栽甘草DNA為模板進(jìn)行Real-time PCR，18S和β-AS基因的Ct值見(jiàn)表2。由表2可知，內(nèi)參基因18S在不同濃度錳處理的甘草根部定量反應(yīng)的Ct值分別在16.38～18.82之間，與對(duì)照(0 mg/L)相比各處理間差異極顯著(P<0.01)，但1.81 mg/L和18.1 mg/L處理間差異不顯著(P>0.05)；目的基因β-AS在不同濃度錳處理的甘草根部定量反應(yīng)的Ct值在20.16～24.24變化，與對(duì)照(0 mg/L)相比各處理間差異極顯著(P<0.01)，且各處理間差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。18 S和β-AS基因均在18.1 mg/L 錳處理濃度時(shí)Ct值最小分別為16.30,20.22，說(shuō)明該濃度處理?xiàng)l件下這2個(gè)基因的循環(huán)閾值最低(見(jiàn)圖4),表達(dá)豐度最高。

圖2 18S和β-AS基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

圖3 18 S和β-AS基因的溶解曲線

基因Ct值0 mg/L1.81 mg/L18.1 mg/L36.2 mg/L54.3 mg/L18S基因18.76+0.06aA16.39+0.01dD16.30+0.08dD17.08+0.11cC17.29+0.08bBβ-AS基因24.16+0.08aA20.51+0.06dD20.22+0.06eE21.55+0.07cC22.73+0.12bB

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，同列數(shù)據(jù)后不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)

圖4 不同濃度錳處理甘草18S和β-AS基因擴(kuò)增曲線

3.4 不同濃度錳處理甘草β-AS基因相對(duì)表達(dá)量的分析 不同濃度錳處理的盆栽甘草Real-time PCR擴(kuò)增后β-AS基因相對(duì)表達(dá)量的分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，隨著錳處理濃度的增加β-AS基因在甘草根部的相對(duì)表達(dá)量亦逐漸增加，而后隨著錳處理濃度的增加又開(kāi)始逐漸下降。18.1 mg/L錳處理濃度時(shí)β-AS基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)最大值為12.43，分別是對(duì)照(0,36.2和54.3 mg/L處理的2.79，1.47，2.88倍，且與這3個(gè)濃度錳處理時(shí)β-AS基因的相對(duì)表達(dá)量差異極顯著(P<0.01)，但與1.81 mg/L錳處理在0.05水平差異顯著(P<0.05)而0.01水平差異不顯著(P>0.01)。這一結(jié)果說(shuō)明,錳處理濃度在18.1 mg/L時(shí)對(duì)甘草β-AS基因在根部的積累表達(dá)最有效，與Ct值結(jié)果相一致。

表3 不同濃度錳處理甘草β-AS基因相對(duì)表達(dá)量

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，同列數(shù)據(jù)后不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P<0.01)

4 討論

基因表達(dá)量作為現(xiàn)代分子生物學(xué)的基礎(chǔ)之一，從根本上闡釋了基因在一定環(huán)境條件下分子和遺傳的機(jī)理[8]。目前，已有許多技術(shù)用于評(píng)價(jià)基因的表達(dá)水平，如Northernblot、RNA protection assay、半定量RT-PCR等。盡管他們各有優(yōu)點(diǎn)，但是與Real-time PCR相比，其準(zhǔn)確性與重復(fù)性都略顯不足，而且這些方法操作繁瑣，不利于開(kāi)展大規(guī)模的檢測(cè)、檢查[9-10]。用Real-timePCR技術(shù)對(duì)β-AS基因進(jìn)行定量測(cè)定，克服了上述缺點(diǎn),是在分子水平對(duì)甘草β-AS基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)的一大進(jìn)步。本實(shí)驗(yàn)利用2-△△Ct相對(duì)定量的方法對(duì)不同濃度錳處理下的盆栽甘草根部β-AS基因相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)，結(jié)果表明β-AS基因的表達(dá)豐度與Ct值(cycle threshold，即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))高度吻合，說(shuō)明PCR擴(kuò)增過(guò)程中β-AS基因的循環(huán)閾值越低其擴(kuò)增效率越高，在植物體內(nèi)表達(dá)的量也越豐富，因此也更容易被檢測(cè)到。

有關(guān)受金屬元素的影響植物體內(nèi)蛋白量會(huì)增加,已有多個(gè)報(bào)道。Tsneg等研究發(fā)現(xiàn)，金屬和溫度脅迫均能增加水稻小分子量(16～20 kDa)熱激蛋白(HSPS)的mRNA水平。除熱激蛋白(HSPS)外，金屬元素還能誘導(dǎo)Ubiquitin、DnaJ-like蛋白、幾丁質(zhì)酶、β-1,3葡聚糖酶、富含脯氨酸細(xì)胞壁蛋白(PRP)、富含甘氨酸細(xì)胞壁蛋白(GRP)和病原相關(guān)蛋白(PR)等基因的表達(dá)[11]。ZIP基因家族可以編碼金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,通過(guò)運(yùn)輸錳來(lái)增強(qiáng)耐性；在高濃度錳供應(yīng)下，MTM1作為MCF家族中的一員也能運(yùn)輸錳,對(duì)于線粒體中SOD2(含錳元素)的合成起著重要作用[2]。由于錳是植物生長(zhǎng)的必須元素，在細(xì)胞水平上廣泛存在于植物的液泡、葉綠體、線粒體、高爾基體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等各個(gè)器官[11]。因此，研究錳對(duì)甘草中甘草酸合成的直接前提物質(zhì)β-香樹(shù)脂醇合成起催化作用的關(guān)鍵酶β-AS的影響顯得尤為重要。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著錳處理濃度的增加甘草β-AS基因的相對(duì)表達(dá)量也顯著增加(P<0.05)，當(dāng)達(dá)到一定濃度(18.1 mg/L)時(shí)開(kāi)始下降，表明甘草β-AS基因的表達(dá)與金屬元素錳含量的高低有明顯的關(guān)系，這種聯(lián)系的產(chǎn)生究其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

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