陳仕欽, 盧小林，陳玉龍，吳 東，楊必賽，王中康*

(1.重慶大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400030； 2.亞洲果業(yè)廣西利添生物科技發(fā)展有限公司，合浦 536128)

柑橘黃龍病防控藥劑篩選試驗初報

陳仕欽1, 盧小林1，陳玉龍1，吳 東2，楊必賽2，王中康1*

(1.重慶大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400030； 2.亞洲果業(yè)廣西利添生物科技發(fā)展有限公司，合浦 536128)

為篩選有效防治罹病柑橘植株體內(nèi)黃龍病菌的藥劑，選取6種藥劑進(jìn)行韌皮部輸液，利用實時定量PCR對病株體內(nèi)帶菌量進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測以確定相對防效。結(jié)果表明，連續(xù)施藥8個月后，硫酸銅、布羅波爾處理組和對照組帶菌量下降了20%～30%，2,2-二溴-3-次氮基丙酰胺、異噻唑啉酮以及氨芐青霉素帶菌量減少了80%以上；ZnSO4處理帶菌量下降了65.60%。各觀察期內(nèi)相對防效都超過50%的藥劑有2,2-二溴-3-次氮基丙酰胺(≥50%)和氨芐青霉素(≥70%)。相對防效分析表明，施藥后8個月1g/L 2,2-二溴-3-次氮基丙酰胺、異噻唑啉酮、氨芐青霉素相對防效分別達(dá)到了89.75%、83.72%和87.27%，初步判斷這3種藥劑對黃龍病病樹有防控效果。

黃龍??； 韌皮部； 2,2-二溴-3-次氮基丙酰胺； 異噻唑啉酮； 氨芐青霉素

柑橘黃龍病(Citrus Huanglongbing，HLB)是世界范圍流行的毀滅性柑橘病害，嚴(yán)重制約柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，各柑橘主產(chǎn)國都將其列為重大植物檢疫性對象。近年來，柑橘黃龍病的傳播范圍越來越廣，危害程度也隨之加劇，難以根除。該病害現(xiàn)已在亞洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的50多個國家和地區(qū)廣泛分布[1-2]。中國的19個柑橘栽培省、區(qū)中已有11個遭受黃龍病危害，受害面積占柑橘栽培總面積的80%以上[3]。

該病病原亞洲種柑橘黃龍病菌(CandidatusLiberibacter asiaticus,Las)屬α-變形菌綱(Alpha-proteobacterial)，是一種限于寄主韌皮部篩管細(xì)胞內(nèi)生活的革蘭氏陰性細(xì)菌。目前，黃龍病菌雖有成功純培養(yǎng)的報告[4]，但尚未通過柯赫氏鑒定和重復(fù)性驗證，因此篩選防治藥劑的工作進(jìn)行遲緩。由于缺乏有效的殺菌劑和抗病品種，挖除病樹、加強(qiáng)檢疫、防控木虱是目前最主要的柑橘黃龍病防控措施[5-6]。基于柑橘寄主內(nèi)黃龍病病原菌防控藥劑的篩選工作也在陸續(xù)進(jìn)行[7-8]，針對黃龍病的特效藥劑尚待研究和開發(fā)。為此，筆者開展了黃龍病防控藥劑的田間防效試驗。

1 材料與方法

1.1 試驗條件

防治對象：柑橘黃龍病亞洲韌皮桿菌(Ca.Liberibacter asiaticus)。

供試品種：‘奧林達(dá)’夏橙6年生結(jié)果樹，供試植株為黃龍病植株(qPCR檢測為陽性)，健康植株作為qPCR檢測陰性對照。

試驗地點：廣西壯族自治區(qū)合浦縣商業(yè)柑橘種植園。

試驗時間：2012年3月—2012年11月。

1.2 供試藥劑

硫酸銅(CuSO4)，市售分析純化學(xué)銅基試劑；硫酸鋅(ZnSO4)，市售分析純化學(xué)純鋅基試劑；殺生劑布羅波爾(bronopol)，醇溶性白色粉末；2,2-二溴-3-次氮基丙酰胺(DBNPA)，醇溶性白色粉末，均購自山東潤鑫精細(xì)化工有限公司；16%異噻唑啉酮(isothiazolin-ketone，Isothz)，母液為黃色液體；氨芐青霉素(ampicillin)，市售醫(yī)用抗生素。

1.3 試驗方案

在樹干或主枝基部捆綁滴藥針頭，植株上部懸掛塑料藥瓶，處理組分別裝入HLB防控藥液硫酸銅、硫酸鋅、布羅波爾、DBNPA、異噻唑啉酮、氨芐青霉素，劑量均為1g/L，對照植株輸以等量清水；藥液傳送滴管采用一次性醫(yī)用輸液器(配針規(guī)格：0.8 mm×28 mm，山東康利萊醫(yī)療器材有限公司)，藥液從韌皮部注射輸入樹體。供試柑橘植株視樹體情況輸液300～600mL，每處理重復(fù)3株成年結(jié)果樹，試驗病樹總共21株，21個小區(qū)，試驗隨機(jī)區(qū)組設(shè)計。施藥后檢查并調(diào)整藥液滴注速度，用輸液管上流速調(diào)節(jié)閥控制滴注速度，以每分鐘1滴為宜；滴注速度不宜過快，流出基部樹干針頭包埋點為宜。試驗區(qū)輔以正常的水肥(葉面肥和根肥)管理和農(nóng)藥(主要防治柑橘木虱)防治措施。處理組和非處理組保持水肥、施藥一致。

從3月21日開始施藥，此后施藥時間是4月25日、5月29日、6月26日、8月15日、9月20日。每次施藥前采集疑似黃龍病植株葉片樣品，在柑橘黃龍病病樹樹冠東南西北中五個方位采集斑駁黃化葉片，每采集點取中下部的成熟葉片各4～5片，每棵樹共采集20～25片葉，采集過程避免樣品之間交叉污染。采集的樣品立即送至實驗室處理或暫時保存到4 ℃條件下。

1.4 DNA的提取及qPCR檢測分析

撕取葉片樣品的中脈，液氮研磨成粉末(約200mg)，根據(jù)天根公司質(zhì)粒小提試劑盒提取DNA的方案提取柑橘葉片中脈樣品DNA。本研究應(yīng)用Wang[9]等在2006年建立的SYBR Green Ⅰ熒光染料法(SGI-qPCR)檢測平臺，引物對CQULA04F/CQULA04是根據(jù)柑橘黃龍病亞洲韌皮桿菌(Las)的核糖體蛋白基因rplJ/rplL(GenBank編號為M94319)特異性靶序列設(shè)計的引物，由上海生物工程公司合成，擴(kuò)增片段大小為87 bp，為單拷貝片段[10-11]。

SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 25 μL的反應(yīng)體系含有終濃度為1× SYBR Green Ⅰ定量IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad,USA)、0.75 μmol/L的引物對CQULA04F/CQULA04R以及2 μL模板。在CFX96C1000Thermal Cycler(Bio-Rad)熒光定量PCR儀上進(jìn)行SGI-qPCR檢測，預(yù)擴(kuò)增95 ℃，1min；95 ℃變性，15 s，59 ℃退火，15 s，72 ℃延伸，20s，41個循環(huán)；在每個循環(huán)的延伸階段設(shè)置同步多次采集熒光。為驗證擴(kuò)增的特異性，在擴(kuò)增完成后立即進(jìn)行熔解曲線的分析，反應(yīng)程序為：95 ℃，30s；55 ℃，30s；從55 ℃開始每升高0.5 ℃保持1s，連續(xù)升高80次(到95 ℃為止)。

由SGI-qPCR檢測分析得到的Ct值通過符合本試驗條件的通用回歸方程Y=-0.288X+11.61轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)，因變量Y代表樣品模板濃度(每個反應(yīng)管中初始DNA拷貝數(shù)，Copy Number/g.c.t，CN/g.c.t)對數(shù)的估計值，自變量X代表測得的Ct值[9-11]。每反應(yīng)管初始模板為2 μL，取自于母液(30μL)，母液DNA提取自200mg的柑橘葉片中脈組織，故每克葉片中脈組織中目的片段拷貝數(shù)或帶菌量，為上述換算所得拷貝數(shù)估計值的75倍。依此建立適合本研究的帶菌量換算方程(1.1)：

CN=75×10-0.288X+11.61

式中：

CN=黃龍病病樹每克組織帶菌量 (拷貝數(shù)，copy number/g,CN/g)；

X= 本反應(yīng)體系測得的Ct值。

按照以上算法，陰性對照判定標(biāo)準(zhǔn)為Ct值>35，就相當(dāng)于陰性樣品每克組織中的DNA拷貝數(shù)或帶菌量小于 2 450CN/g。

1.5 藥劑防效評測方法

施藥期間觀察樹勢及藥害發(fā)生情況，并根據(jù)處理區(qū)和對照區(qū)的HLB帶菌率差異計算相對防效。利用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件對各處理重復(fù)小區(qū)的田間相對防效進(jìn)行鄧肯氏新復(fù)極差多重比較(one-way ANOVA/Duncan test)。根據(jù)以下公式計算HLB帶菌量減退率及相對防效百分率。

HLB帶菌量減退率(%)=

相對防效(%)=

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藥劑輸液處理對柑橘植株體內(nèi)帶菌量的影響

對黃龍病染病植株進(jìn)行連續(xù)8個月的樹體藥劑輸液，每次施藥前采集葉片進(jìn)行實時熒光定量PCR連續(xù)監(jiān)測。結(jié)果顯示各藥劑連續(xù)處理8個月后，病樹黃龍病帶菌量均有下降，但帶菌量變化趨勢不同(圖1)。從初次施藥(3月21日)到11月底，DBNPA、異噻唑啉酮以及氨芐青霉素藥劑處理的植株黃龍病菌數(shù)量呈現(xiàn)減少的趨勢，帶菌量較基期減少了80%以上。而CuSO4、ZnSO4、布羅波爾(bronopol)和清水(CK)處理的病株帶菌量在施藥期間呈現(xiàn)起伏狀態(tài)，前3個月都呈一定的下降趨勢，到了第5、6月帶菌量呈增長趨勢，此期之后ZnSO4和CK組帶菌量又明顯降低。施藥后8個月連續(xù)每月取樣測試柑橘植株體內(nèi)的帶菌數(shù)量動態(tài)， ZnSO4處理組帶菌量下降了65.60%，表明對病害有一定的抑制作用。而CuSO4、Bronopol處理組及對照組，帶菌量僅下降20%～30%。

圖1 不同藥劑韌皮部輸液處理前后柑橘植株體內(nèi)帶菌量變化趨勢Fig.1 The monitoring dynamics of bacterial titers of HLB-affected citrus plants phloem-injected with six different chemicals in the field

對照組及所有處理組在施藥后第3個月(6月26日)帶菌量都達(dá)到低谷，而之后各處理帶菌量呈現(xiàn)不同增長。各處理組帶菌量高峰期集中在第2次施藥之前(3月下旬到4月25日)，而對照組帶菌量兩次高峰則出現(xiàn)在第2次施藥之前(4月25日)以及施藥后第4.5個月(8月15日)。

2.2 不同藥劑輸液處理對黃龍病的防治效果

6種藥劑對黃龍病的相對防效變化情況見圖2，根據(jù)HLB防控動態(tài)檢測結(jié)果，各觀察期內(nèi)氨芐青霉素相對防效均≥70%，DBNPA相對防效超過50%；8個月后相對防效在50%～ 80%的藥劑處理有4個，其余處理小于50%。

從各月防治效果情況來看，施藥一個月后并不能達(dá)到最佳的控病效果，異噻唑啉酮在施藥后第3個月后才能達(dá)到比較高且穩(wěn)定的防效。施藥后第3個月、第4、5個月以及第6個月，各藥劑處理相對防效都超過50%。其中，施藥后第4～5個月(5月29日)各處理相對防效都超過70%。

圖2 六種藥劑韌皮部輸液處理后對柑橘黃龍病樹體內(nèi)帶菌量的相對防效變化情況Fig.2 The change in the control effects of six different chemical compounds against HLB-affected citrus plants by phloem-injection in 8 months

表1 四種藥劑對柑橘黃龍病韌皮部輸液的防效結(jié)果1)Table 1 The control effects of four different chemicals against HLB by phloem-injection treatment

1) 表中所列數(shù)據(jù)都是3個重復(fù)處理的平均值。處理間數(shù)據(jù)標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05，Duncan test)。 All data in the table are the average for three repetitions.The data followed by different letters at the same column indicate significant differences among different treatments at 5% level (one-way ANOVA/Duncan test).

2.3 田間癥狀觀察

連續(xù)間隔施藥8個月后，柑橘植株都未發(fā)現(xiàn)明顯的癥狀消退，葉片斑駁、黃化、黃梢與大小果為主要表現(xiàn)病癥。由于注射器針管的直接接觸和藥液的持續(xù)性輸入，6種不同藥劑施藥后，施藥部位的韌皮組織均呈現(xiàn)不同程度的物理性傷口和生理性病害，包括流膠、腐蝕腐爛和真菌、昆蟲的侵染，但隨著病樹的自身防御系統(tǒng)的啟動，注藥傷口會在1～2個月后得到修復(fù)。在各藥劑1g/L處理濃度下，觀察期內(nèi)樹體除了黃龍病癥外，生長均無異常，沒有出現(xiàn)系統(tǒng)性的藥害。

3 結(jié)論與討論

從3月到11月的帶菌量變化(圖1)可以看出，對照組在3-5月以及8-9月有較高的帶菌量，這可能是自然條件下柑橘體內(nèi)葉脈帶菌量受到氣候等因素影響的結(jié)果。各處理組帶菌量也存在類似的趨勢，只是變化幅度存在差異，可能原因是不同藥劑在試驗濃度下對樹體葉脈帶菌量抑制下限不同，且各處理藥效發(fā)揮時間、持效作用或存在差異。

韌皮部輸液篩選出的幾種殺菌劑，樹體輸液處理8個月后1g/L的DBNPA、異噻唑啉酮、氨芐青霉素相對防效分別達(dá)到了89.75%、83.72%和87.27%，對黃龍病有明顯的抑制效果。本研究中使用1g/L氨芐青霉素作為處理對照，對黃龍病相對防效可以達(dá)到80%以上，但抗生素只能暫時緩解黃龍病的病狀[7]。通過加壓注射四環(huán)素可使病樹樹勢得以恢復(fù)，延長病樹結(jié)果年限可達(dá)5～6年，但四環(huán)素不能完全防治黃龍病，且病源可能會傳播蔓延[12]。四環(huán)素注射的病樹在初期易引起葉片焦枯、葉脈褐化與大量落葉等暫時性藥害，但半年內(nèi)樹體可恢復(fù)生長，此法適用于發(fā)病早期的治療[13]。Muqing等人[14]的研究表明:5 g青霉素和0.5 g的四環(huán)素同時施用能有效控制黃龍病，降低藥害同時減少抗藥性，在生產(chǎn)上的應(yīng)用價值尚待商榷?？股厥┯糜谵r(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，主要進(jìn)入土壤及地表水、地下水環(huán)境，并通過作物吸收和積累進(jìn)入食物鏈，同時致病菌因抗生素的頻繁施用而誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗藥性基因也隨之?dāng)U散，對動物和人體健康構(gòu)成潛在危害[15]，因此抗生素在生產(chǎn)上并非理想的黃龍病防控藥劑，不建議推廣應(yīng)用。由于抗生素如氨芐青霉素、四環(huán)素等對黃龍病防控速效性較高，在防控藥劑篩選試驗中可作為供試試劑的參照藥劑。氨芐青霉素在各施藥期間的相對防效都可達(dá)70%以上，DBNPA次之(達(dá)50%以上)，初期防效和防效穩(wěn)定性都高于異噻唑啉酮。DBNPA和異噻唑啉酮在施藥8個月后控病效果與氨芐青霉素?zé)o顯著性差異，且是兩種環(huán)保型的殺菌劑，對黃龍病的防控作用可以作進(jìn)一步的藥效評估。

以韌皮部輸液進(jìn)行黃龍病防控藥劑篩選，其優(yōu)勢在于藥劑可直接作用于韌皮部的黃龍病菌，同時減少了藥劑對生態(tài)環(huán)境的污染。但是藥劑在韌皮部向樹體其他組織輸導(dǎo)的方向和能力不盡相同[16]，僅僅依靠葉脈組織帶菌量的變化評價防效只能初步判斷篩選藥劑是否有效，而整體防治效果還需對施藥后的病癥變化情況進(jìn)行觀察評估。通過8個月的帶菌量監(jiān)測，DBNPA、異噻唑啉酮和氨芐青霉素處理的相對防效達(dá)到90%，但病癥改善不明顯。因此，根據(jù)帶菌量變化及相對防效分析，初步篩選出這幾種藥劑對黃龍病具有防控效果。

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PreliminaryreportonscreeningofchemicalcompoundsagainstthecitrusHuanglongbingbacteriumCandidatusLiberibacterasiaticusincitrusplants

Chen Shiqin1, Lu Xiaolin1, Chen Yulong1, Wu Dong2, Yang Bisai2, Wang Zhongkang1

(1.CollegeofLifeSciences,ChongqingUniversity,Chongqing400030,China；2.LuckyTeamBiotechDevelopment(Hepu)Ltd.,Co.，Guangxi536128,China)

In order to screen effective chemical compounds against the citrus Huanglongbing (HLB) bacteriumCandidatusLiberibacter asiaticus in citrus plants,6chemical compounds were injected into phloem.HLB bacterial titers were dynamically measured by real-time quantitative PCR to determine the control effect.The results showed that,after eight months of continuous injection,the bacterial titers of copper sulfate,bronopol and the control dropped by 20%-30% versus a 65.60% decline in ZnSO4treatment,while 2,2-dibromo-3-nitrilopropionamide (DBNPA),isothiazolin-ketone and ampicillin achieved more than 80% decrease of bacterial titers.The control effects all reached more than 50% by both treatments of DBNPA (≥ 50%) and ampicillin (≥ 70%) during each observation period over eight months.The control efficiency analysis demonstrated that the control effects of DBNPA,isothiazolin-ketone and ampicillin were 89.75%,83.72% and 87.27%,respectively,at the same dosage of 1g/L after eight months of initial treatment.This preliminary study indicated that these three chemical compounds suppressed theCaL.asiaticus in HLB-affected citrus plants.

Huanglongbing; phloem; 2,2-dibromo-3-nitrilopropionamide; isothiazolin-ketone; ampicillin

2013-05-07

：2013-06-21

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201003067)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金 (CDJXS112300)

S 482.2，S 436.661

：BDOI：10.3969/j.issn.0529-1542.2014.02.033

* 通信作者 Tel：023-65120489；E-mail: w-zk@163.com