賀甫威， 葉紅華， 費曉紅， 樓燕如， 王世奇， 楊 銳， 胡燁文， 陳曉敏

(寧波市第一醫(yī)院心內科，浙江 寧波 315010)

內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)為血管內皮細胞的前體細胞，由骨髓動員到外周血中。它們具有一定的擴增能力及分化潛能，在胚胎期參與血管的形成，出生后可參與受損血管的修復[1-2]。冠心病的本質上是一種血管疾病，由于內皮祖細胞參與血管內皮修復，因此在冠心病發(fā)生發(fā)展中循環(huán)內皮祖細胞的缺乏可能起到重要作用[3]。他汀類藥物也稱3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑，具有競爭性抑制細胞內膽固醇合成早期過程中限速酶的活性，繼而上調細胞表面低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)受體，加速血漿LDL的分解代謝，降低血漿中LDL；此外，還具有抑制平滑肌細胞增殖、抑制血小板聚集、抗炎及穩(wěn)定斑塊的作用[4-7]；在臨床上已被廣泛應用于抗動脈粥樣硬化。近年來，以ARMYDA系列研究為代表的他汀類藥物對經皮冠狀動脈介入術(percutaneous coronary intervention，PCI)圍術期干預的相關研究提示術前強化他汀負荷治療或長期服用他汀治療的患者術前再負荷可顯著降低圍術期心梗等主要心血管不良事件[8]。然而在不同的研究中他汀再負荷的方案大不相同，同時不同他汀的負荷方案對他汀多效性影響的研究較少。因此，我們比較了3種PCI術前阿托伐他汀再負荷方法對長期服用他汀的穩(wěn)定性冠心病患者圍術期循環(huán)內皮祖細胞及炎癥因子的影響。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

血清肌鈣蛋白I(troponin I，TnI)檢測試劑盒(Beckman Coulter)； C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)由SYNCHRON System測定 (Beckman Coulter)；可溶性細胞間附分子Ⅰ (soluble intercellular adhesion molecule 1,sICAM-1) ELISA 試劑盒(Bender)；藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標記的小鼠抗人CD133/AC133和CD144單克隆抗體(Miltenyi Biotec)；藻紅蛋白-花青素5(phycoerythrin and cyanidin 5，PC5)標記的鼠抗人CD45單克隆抗體(Beckman Coulter)；別藻藍蛋白(allophycocyanin，APC)標記的鼠抗人CD34單克隆抗體(Miltenyi Biotec)；FITC標記的小鼠抗人VEGFR-2/KDR單克隆抗體和流式檢測專用紅細胞裂解液(R&D)。

2 患者資料

45例長期服用他汀的并選擇擇期行PCI的穩(wěn)定性冠心病患者隨機分成3組。穩(wěn)定性冠心病患者定義為：由于運動或其它增加心肌需氧量的情況所誘發(fā)的短暫胸痛發(fā)作，休息或舌下含服硝酸甘油后疼痛?？裳杆傧也〕谭€(wěn)定在1個月以上[9]。入選標準：45歲以上80歲以下男性及絕經后女性；長期接受他汀治療(>8周)，接受擇期PCI術。排除標準：急性冠脈綜合征，糖尿病，ALT/AST大于正常上限，肌酐>30 mg/L，左心室射血分數(shù)<30%，具有明確感染灶的急慢性感染，血液系統(tǒng)疾病，腫瘤，全身免疫性疾病。

3 方法

3.1分組 45例符合入排標準的患者隨機分成3組。所有患者 PCI術前1 h、術后1 h、術后6 h及術后24 h分別留取外周血用于EPCs測定。PCI術前即刻及術后24 h測定TnI水平；按照2012年發(fā)布的第三版全球心肌梗死定義中PCI相關心肌梗死的定義為PCI術后肌鈣蛋白較99%正常上限值升高達5倍[10]。sICAM-1與CRP是被認為與冠心病相關的炎癥因子，我們分別于PCI術前即刻及術后24 h測定這2種蛋白的外周血水平。臨床隨訪了PCI術后30 d的主要不良心臟事件(major adverse cardiac events，MACEs)，包括死亡、非致死性心肌梗死和靶血管血運重建事件。

3.2內皮祖細胞檢測 將所采集的3mL靜脈全血標本各取100μL，分別加入4管BD公司流式細胞儀專用檢測管中；各加入5μL胎牛血清，室溫條件下孵育15min以阻斷Fc片段。隨機抽取1管作陰性對照，抽取第2管中加入10μL由PE標記的CD133/AC133抗體及10μL由FITC標記的VEGFR-2/KDR抗體，在第3管中加入10μL由FITC標記的VEGFR-2/KDR抗體及由APC標記的CD34抗體，最后1管中加入10μL由FITC標記的VEGFR-2/KDR抗體及PE標記的CD144抗體，最后在所有檢測管中加入PC5標記的CD45抗體5μL，混勻后置于4 ℃冰箱中避光孵育45min。混勻后加入流式細胞儀檢測專用紅細胞裂解液裂解紅細胞，振蕩混勻，置于37 ℃恒溫箱中避光放置10min，接著以1 500r/min離心5min后棄上清；再加入3mLPBS，混勻后以1 500r/min再次離心5min，棄上清，加入500μLPBS液，充分振蕩混勻，最后利用FACSCalibur流式細胞儀分別檢測分析100μL中CD45-/CD133+/CD34+標記細胞CD45-/CD34+/KDR+以及CD45-/CD144+/KDR+標記細胞的總數(shù)來代表外周血EPCs數(shù)量。

4 統(tǒng)計學處理

所有資料利用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用方差分析；計數(shù)資料比較采用卡方檢驗；對有相關趨勢的變量進行相關分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 基本情況的比較

3組患者組間基線特征匹配良好，無顯著差異，見表1；PCI治療及術后MACEs發(fā)生情況統(tǒng)計均無明顯差異,見表2。

表1 患者臨床基線資料

表2 3組患者PCI治療及MACE事件

MACEs included death in 30 d after PCI, non-fatal myocardial infarction and target vessel revascularization.

2 PCI術前與術后內皮祖細胞的變化

在80 mg再負荷組，標記為CD45-/CD133+/CD34+和CD45-/CD34+/KDR+的EPCs 術后1 h及術后6 h與術前相比明顯升高(P<0.05)，見表3。80 mg再負荷組標記為CD45-/CD133+/CD34+的 EPCs 術后1 h及術后6 h較術前相比分別升高了1.6倍及1.3倍。標記為CD45-/CD34+/KDR+的EPCs術后1 h及術后6 h較術前相比分別升高了1.4倍和1.7倍。標記為CD45-/CD144+/KDR+的EPCs水平術后較術前無顯著差異。對照組及40 mg再負荷組患者術前與術后外周血內皮祖細胞水平的比較無顯著差異，見表3。80 mg再負荷組標記為CD45-/CD133+/CD34+及 CD45-/CD34+/KDR+的EPCs 在術后6 h達到最高峰，并且在術后24 h恢復到術前水平。對照組及40 mg再負荷組，大部分患者的內皮祖細胞水平術后1 h達到最高峰并且基本維持在這一水平。

表3 3組患者不同抗體標記的內皮祖細胞PCI術前及術后不同時點的變化情況

*P<0.05 vspre-operation.

3 PCI術前與術后sICAM-1 與CRP的變化

3組患者術后sICAM-1及CRP水平均較術前升高，其中無負荷組升高最為明顯，與術前相比差異顯著(P<0.05)；40 mg再負荷組和80 mg再負荷組術后sICAM-1及CRP水平雖有升高，但與術前比較無顯著差異，見表4。另外，他汀的劑量增加伴隨著術后炎癥因子水平的下降，提示大劑量他汀再負荷治療可以減少圍術期血漿炎癥水平。

表4 3組患者PCI術前與術后sICAM-1 及CRP的變化情況

*P<0.05vspre-operation.

4 PCI術前與術后血清TnI的變化

在3組患者中術后血清TnI水平均較術前顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義。但他汀再負荷組，圍術期的心肌損傷較對照組存在減輕趨勢。80 mg再負荷組術后血清TnI增加水平與對照組相比明顯減少，見表5。按照2012年發(fā)布的第三版全球心肌梗死定義中PCI相關心肌梗死的定義(PCI術后肌鈣蛋白較99% 正常上限值升高達5倍)，無他汀負荷組為8例，40 mg他汀負荷組為6例，80 mg他汀負荷組為3例；他汀再負荷組較無他汀負荷組發(fā)生圍術期心肌梗死呈減少趨勢。

表5 3組患者PCI術前術后TnI水平的比較

*P<0.05vspre-operation.

討 論

冠心病患者往往合并存在內皮祖細胞動員減少及功能下降[11-14]。ARMYDA-RECAPTURE研究證實PCI術前他汀再負荷治療可以減輕圍術期心肌損傷。同時Vasa等[16]的研究顯示在冠心病患者服用阿托伐他汀(40 mg/d)治療4周后，外周血內皮祖細胞數(shù)量較服用前顯著增加。然而Hristov等[17]的研究顯示長期(大于8周)應用他汀治療可降低外周血內皮祖細胞數(shù)量。上述不同發(fā)現(xiàn)使我們想到是否因為長期他汀治療使內皮祖細胞對常規(guī)劑量他汀治療不再敏感； 也可能是因為長期他汀治療使結合內皮祖細胞的整聯(lián)蛋白正向調節(jié)，這就要求更大劑量的他汀類藥物以促進內皮祖細胞的動員；最后PCI術前他汀如何治療可以使獲益最大化需要進一步研究來探討。

EPCs是人體生理或病理過程中一群動態(tài)演變的細胞系列。在體外培養(yǎng)中，附著在培養(yǎng)皿表面的EPCs從橢圓形逐漸變成紡錘形，隨著內皮祖細胞的分化和成熟，EPCs開始表達特定的內皮細胞標志物，這使得他們能夠從其它的各種干細胞和骨髓細胞中成熟的內皮細胞類型區(qū)分開來。以CD34+/CD133+/KDR+來標記內皮祖細胞是目前主要一種方式。體外標記為CD133+的細胞在外周血中可被誘導分化成內皮細胞，此時它們不再表達CD133，因此CD133的表達是內皮祖細胞的特定標簽，并可以使內皮祖細胞從成熟內皮細胞中區(qū)分出來。CD34被認為是造血干/祖細胞的標志物，但標記為CD34-的EPCs亞群也有報道[18]。KDR是表達在成熟內皮細胞和內皮祖細胞細胞膜上的酪氨酸激酶受體。然而，內皮祖細胞不表達血管性血友病因子(vWF)和血管內皮鈣黏蛋白(CD144)[11]。隨著內皮祖細胞分化和成熟，vWF及CD144的表達增強，CD133的表達降低。一旦內皮祖細胞分化為成熟的內皮細胞，CD133的表達缺失。最后，CD45是白細胞的表面標記，在內皮祖細胞中基本不表達。因此，將不同的表面比較組合起來可以區(qū)分不同分化階段的內皮祖細胞。因此本研究中檢測分別代表祖細胞(CD45-/CDl33+/CD34+標記細胞)，分化較早期的EPCs (CD45-/CD34+/ KDR+標記細胞)和分化較晚期的EPCs(CD45-/CD144+/ KDR+標記細胞)系列以期較為全面地反映EPCs在PCI圍術期的的變化。

在我們的研究中，2種他汀再負荷治療方案均能減少患者圍術期心肌損傷，但是術前12 h服用80 mg阿托伐他汀及術前2 h追加40 mg阿托伐他汀再負荷方案較無他汀負荷組圍術期心肌損傷的減少顯著(P<0.05)，而PCI術前連續(xù)7 d服用40 mg阿托伐他汀再負荷治療與無負荷組比較，圍術期心肌損傷僅呈減少趨勢。我們的研究顯示在無他汀負荷組患者中長期他汀治療的圍術期循環(huán)內皮祖細胞的水平并不增高，但PCI術前給予短期大劑量阿托伐他汀治療的患者可以提高圍術期循環(huán)分化較早期內皮祖細胞的水平。上訴研究結果表明在長期服用他汀治療的患者中PCI術前短期大劑他汀治療可以動員骨髓內皮祖細胞。我們研究的局限性是一個相對較小的樣本規(guī)模和缺乏對EPCs的功能研究。此外，圍PCI手術期心肌缺血可能通過活化血管內皮生長因子刺激內皮祖細胞活化；其它PCI相關病理生理改變特別是在對照組中EPCs活化可能影響了血清sICAM-1和CRP血清水平。另外，PCI術中心肌缺血可能通過刺激血管內皮生長因子的釋放而動員內皮祖細胞的同時也會帶來其它的病理生理改變特別是在對照組中出現(xiàn)的sICAM-1及CRP水平的升高。

總之，我們的研究結果提示PCI術前短期大劑量再負荷治療可以提高長期服用他汀治療的穩(wěn)定性冠心病患者PCI治療效果。PCI術前短期接受大劑量他汀再負荷治療的穩(wěn)定性冠心病患者外周血分化較早期的內皮祖細胞顯著升高并且心肌損傷指標血清TnI顯著降低。阿托伐他汀是我們的研究中唯一用到的他汀并且樣本量較小，在以后的研究中可以增加樣本量同時可以使用其它種類的他汀來觀察是否有類似作用。

致謝: 感謝寧波市第一醫(yī)院實驗室周影在流式細胞儀應用方面的指導，感謝陳瑩在本實驗期間提供的幫助。

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