肖 麗，陳立青，戴方偉，宋曉明，郭紅剛，盧領(lǐng)群，呂 宇，薩曉嬰

(1. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與安全性評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 杭州 310013；2. 杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 杭州 310036)

長爪沙鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已有較長時(shí)間，其獨(dú)特的解剖學(xué)、生理學(xué)和行為學(xué)等特征使其在微生物感染、營養(yǎng)代謝病、腦血管疾病、自發(fā)性腫瘤和慢性鉛中毒等諸多研究中應(yīng)用廣泛[1]。更深入細(xì)致的生理學(xué)特性研究將有助于拓展該動(dòng)物在人類疾病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究中發(fā)揮更大的應(yīng)用價(jià)值，也有助于加快長爪沙鼠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化進(jìn)程。目前，有關(guān)長爪沙鼠生殖特性的文獻(xiàn)已有報(bào)道[2,3]，但僅包括性成熟時(shí)間、產(chǎn)仔數(shù)量等概況，關(guān)于長爪沙鼠動(dòng)情周期血清激素變化和卵泡發(fā)育的研究，國內(nèi)未見報(bào)道，而陸續(xù)開展的長爪沙鼠生殖生理、胚胎移植等研究亟需上述背景信息。基于此，本文對長爪沙鼠動(dòng)情周期各階段卵巢形態(tài)、卵泡數(shù)量和血清激素水平等進(jìn)行了觀察測定，以期逐步揭示其生殖機(jī)理，為長爪沙鼠的進(jìn)一步應(yīng)用提供基礎(chǔ)參數(shù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

未交配成年清潔級雌性長爪沙鼠，4月齡，50 g～60 g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)于12 h光照和12 h黑暗的環(huán)境中，溫度20 ℃～26℃，濕度40%～70%，有通風(fēng)系統(tǒng)保持室內(nèi)空氣流暢，動(dòng)物自由攝食和飲水。生產(chǎn)許可證號為SCXK(浙)2008-0034，使用許可證號為SYXK(浙)2008-0114，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 試劑和儀器

主要試劑為生理鹽水、蘇木精-伊紅染液、ELISA試劑盒(購自上海博谷生物科技有限公司)等。主要儀器有Leica CM1900冰凍切片機(jī)(上海來卡儀器有限公司)、Leica DM2500熒光顯微鏡成像系統(tǒng)(上海來卡儀器有限公司)、Bio-Rad Model 680酶標(biāo)儀、細(xì)胞分類計(jì)數(shù)器、細(xì)胞計(jì)數(shù)板等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 長爪沙鼠動(dòng)情周期的確定：每天早上8:30保定動(dòng)物，以30 μL生理鹽水輕輕沖洗長爪沙鼠陰道后吸出，加至潔凈的96孔板中直接鏡檢，觀察細(xì)胞的種類和形態(tài)[4]，根據(jù)下述判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行動(dòng)情周期判斷。①動(dòng)情前期：持續(xù)時(shí)間為(21.0±10.0)h，陰道涂片中可見大量橢圓形的有核上皮細(xì)胞，偶見少量角化細(xì)胞；②動(dòng)情期：持續(xù)時(shí)間為(25.8±9.8)h，陰道涂片可見大量外形不規(guī)則的角化上皮細(xì)胞，偶有少量有核上皮細(xì)胞；③動(dòng)情后期：持續(xù)時(shí)間為(17.6±8.7)h，陰道涂片不規(guī)則角化上皮細(xì)胞、有核上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞均可見，且比例相當(dāng)；④動(dòng)情間期：持續(xù)時(shí)間為(48.0±37.8)h，可見大量淋巴細(xì)胞及少量有核上皮細(xì)胞[4]。

1.3.2 標(biāo)本采集：待確定長爪沙鼠的動(dòng)情周期后，眼球采血，采血時(shí)防止溶血和雜質(zhì)污染。室溫放置30 min，2 500 r/min離心10 min，分離血清，分裝成2個(gè)EP管，-20℃ 保存。室溫下，采用頸椎脫臼法處死長爪沙鼠，剝離雙側(cè)卵巢，用 4%甲醛溶液固定后常規(guī)石蠟包埋切片，置于Leica切片機(jī)上連續(xù)切片，厚度為5 μm，蘇木精-伊紅染色后進(jìn)行顯微鏡觀察并拍照。

1.3.3 卵泡的計(jì)數(shù):取長爪沙鼠的雙側(cè)卵巢，固定后進(jìn)行石蠟切片，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)各樣本切片的原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡和黃體的數(shù)目。哺乳類動(dòng)物隨著動(dòng)情周期變化卵巢內(nèi)會(huì)出現(xiàn)不同數(shù)量的卵泡和黃體，按下述方法進(jìn)行判斷[5]。①原始卵泡：靠近白膜，中央有一個(gè)卵細(xì)胞，其外周為單層扁平的卵泡細(xì)胞；②初級卵泡：初級卵母細(xì)胞體積較大，單層或多層(5～6層)立方形或柱狀卵泡細(xì)胞；③次級卵泡：卵泡體積擴(kuò)大，形成卵丘，卵泡細(xì)胞增至6～12層；④成熟卵泡：卵泡體積很大，并向卵巢表面突出，顆粒層很薄，卵丘非常明顯；⑤黃體：排卵后殘留在卵巢內(nèi)的卵泡壁塌陷，卵泡膜的結(jié)締組織和血管等伸入到顆粒層，在LH的作用下演變成體積較大，富含毛細(xì)血管并具有分泌功能的細(xì)胞團(tuán)。

表1 長爪沙鼠動(dòng)情周期各時(shí)相的卵泡和黃體數(shù)量

1.3.4 性激素水平的測定:用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA法)[6,7]定量測定各組長爪沙鼠血清催乳素(PRL)、雌二醇(E2)、促卵泡刺激素(FSH)和黃體生成素(LH)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 長爪沙鼠動(dòng)情周期各階段陰道涂片的觀察

長爪沙鼠動(dòng)情周期中各時(shí)相陰道涂片的特點(diǎn)：①動(dòng)情前期陰道涂片主要以有核上皮細(xì)胞為主(圖1A)；②動(dòng)情期主要為不規(guī)則的角化細(xì)胞，圖1B；③動(dòng)情后期可觀察到不規(guī)則角化上皮細(xì)胞、有核上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞均存在，以角化細(xì)胞、淋巴細(xì)胞兩者為主，圖1C；④動(dòng)情間期時(shí)主要為淋巴細(xì)胞，偶有少量有核上皮細(xì)胞(圖1D)(圖1見彩插2)。

2.2 動(dòng)情周期卵巢形態(tài)觀察和卵泡數(shù)量的變化

由表1可見，長爪沙鼠動(dòng)情周期各時(shí)相原始卵泡數(shù)量自動(dòng)情前期開始呈現(xiàn)先減少后增多的趨勢，初級卵泡和次級卵泡數(shù)量在各時(shí)相差異未見顯著性，成熟卵泡數(shù)量先增多再減少，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。長爪沙鼠動(dòng)情前期和動(dòng)情期的卵泡數(shù)量較多，其中動(dòng)情前期初級卵泡數(shù)量居多，次級卵泡和成熟卵泡開始生成，見圖2A。動(dòng)情期的成熟卵泡數(shù)量多于動(dòng)情周期其他時(shí)相，并逐漸有新的黃體形成(圖2B)。動(dòng)情后期原始卵泡和初級卵泡相比于其他時(shí)相有所增多，其中初級卵泡較各時(shí)相最多，黃體數(shù)量增多，見圖2C。動(dòng)情間期原始卵泡和初級卵泡較多，黃體數(shù)量顯著性低于動(dòng)情前期、動(dòng)情期和動(dòng)情后期(P<0.05)，且較大呈片狀，見圖2D(圖2見彩插2)。動(dòng)情周期各時(shí)相間各級卵泡數(shù)量差異未見顯著性。

2.3 動(dòng)情周期血清PRL、E2、 FSH 和LH水平的變化

長爪沙鼠血清PRL水平從動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期至動(dòng)情間期分別為(3.43±0.27)ng/mL、(5.11±0.27)ng/mL、(5.15±0.37)ng/mL、(7.58±0.18)ng/mL，呈逐漸升高，動(dòng)情間期PRL水平與其他各組差異顯著(P<0.05)，見圖3A。血清E2水平從動(dòng)情前期至動(dòng)情間期分別為(42.45±2.83)mIU/mL、(23.29±2.20)mIU/mL、(20.42±0.60)mIU/mL、(22.42±0.25)mIU/mL，由前期到間期逐漸減少，動(dòng)情前期血清E2水平顯著性高于其他各組(P<0.05)，見圖3B。長爪沙鼠血清FSH水平(圖3C)從動(dòng)情前期到動(dòng)情間期分別是(4.47±0.45)mIU/mL、(2.87±0.37)mIU/mL、(1.96±0.07)mIU/mL、(0.91±0.04)mIU/mL，整體呈下降趨勢，動(dòng)情前期FSH水平顯著性高于動(dòng)情后期和動(dòng)情間期(P<0.05)。血清LH水平從動(dòng)情前期到動(dòng)情間期分別是(4.77±0.52)mIU/mL、(7.07±0.48)mIU/mL、(4.81±0.38)mIU/mL、(11.11±0.31)mIU/mL，呈逐漸升高，至動(dòng)情間期達(dá)到峰值，并顯著性高于其他各組(P<0.01)，見圖3D。

(A)圖為血清催乳素(PRL)水平，(B)圖為血清雌二醇(E2)水平，(C)圖為血清促卵泡刺激素(FSH)水平，(D)圖為血清黃體生成素(LH)水平。P為動(dòng)情前期，E為動(dòng)情期，M為動(dòng)情后期，D為動(dòng)情間期。

3 討論

本文根據(jù)雌性嚙齒類動(dòng)物在動(dòng)情周期的不同時(shí)相，陰道黏膜受卵巢雌、孕激素的影響會(huì)發(fā)生典型變化的原理[8]，用直接鏡檢法計(jì)數(shù)角化細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)陰道脫落細(xì)胞的類型及比例，從而確定長爪沙鼠動(dòng)情周期的四個(gè)時(shí)相[4]，并采用ELISA法測定長爪沙鼠動(dòng)情周期各時(shí)相性激素的變化。長爪沙鼠動(dòng)情周期期間血清中促性腺激素(FSH和LH)、催乳素(PRL)和雌二醇(E2)的動(dòng)態(tài)變化與動(dòng)情周期各時(shí)相的卵泡和黃體生成密切相關(guān)。在動(dòng)情前期，血清E2增多，通過對下丘腦的反饋?zhàn)饔谜{(diào)節(jié)GnRH和促性腺激素大量分泌，引起FSH在動(dòng)情前期含量急劇增高，促進(jìn)卵巢卵泡的快速生長。血清LH水平從動(dòng)情前期到動(dòng)情間期呈逐漸升高，先在動(dòng)情期達(dá)到一個(gè)峰，動(dòng)情后期有所下降，至動(dòng)情間期達(dá)到最高峰(圖3D)。E2通過正反饋?zhàn)饔米饔糜谙虑鹉X的周期中樞，引起排卵前LH增高[9]。在動(dòng)情間期血清E2的含量稍微增加， LH大量增多(圖3)，在LH峰出現(xiàn)之后，卵泡的內(nèi)膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞開始黃體化[9]，在動(dòng)情前期生成大量黃體(表1)。FSH從動(dòng)情前期到動(dòng)情間期，呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，動(dòng)情前期達(dá)到峰值(圖3C)，為卵泡發(fā)育和LH的生成奠定了基礎(chǔ)。FSH可促進(jìn)卵巢卵泡的生長，促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞的增生和雌激素的合成和分泌，并可刺激卵泡細(xì)胞上LH受體產(chǎn)生，而LH可促進(jìn)卵泡的成熟和排卵，刺激卵泡內(nèi)膜細(xì)胞產(chǎn)生雄激素(為顆粒細(xì)胞合成雌激素提供前體物質(zhì))，并可促進(jìn)排卵后的顆粒細(xì)胞黃體化，維持黃體細(xì)胞分泌孕酮[9]。FSH和LH在動(dòng)情周期中相互協(xié)調(diào)，對動(dòng)情周期中卵泡發(fā)育和黃體生成至關(guān)重要。PRL在未經(jīng)交配的嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)有促黃體溶解的功能[9]。血清PRL在動(dòng)情間期達(dá)到峰值，當(dāng)PRL血清濃度達(dá)到最高，黃體逐漸退化，卵巢內(nèi)的黃體數(shù)量達(dá)到最低(表1)。動(dòng)情間期黃體的退化為新一周期的黃體生成奠定了基礎(chǔ)，也為新一周期的卵泡發(fā)育提供了空間。長爪沙鼠動(dòng)情周期中出現(xiàn)的FSH和E2峰值的時(shí)相與大小鼠一致[7,10,11]。而PRL和LH出現(xiàn)峰值的時(shí)相與大小鼠有差異，大小鼠的血清PRL和LH均在動(dòng)情前期出現(xiàn)峰值[7,10, 12]。另外，關(guān)于長爪沙鼠動(dòng)情周期血清PRL、FSH和E2水平出現(xiàn)峰值的時(shí)相，Lv XH等[6,7]的結(jié)果與本研究結(jié)果相同。Lv XH等[7]在長爪沙鼠動(dòng)情期測到LH的峰值，本研究在動(dòng)情間期測得LH峰值，LH動(dòng)情周期各時(shí)相的血清含量變化與黃體計(jì)數(shù)的結(jié)果一致，動(dòng)情間期血清LH出現(xiàn)峰值，促進(jìn)黃體大量生成，黃體的數(shù)量在動(dòng)情前期達(dá)到最多。動(dòng)情周期各時(shí)相中各級卵泡數(shù)量未見顯著性差異，有待進(jìn)一步研究。

隨著長爪沙鼠科研用途的不斷擴(kuò)展，動(dòng)情周期各時(shí)相卵泡數(shù)量與血清激素水平變化規(guī)律的揭示將完善長爪沙鼠生殖生理特性，為長爪沙鼠應(yīng)用于婦科、產(chǎn)科和計(jì)劃生育等醫(yī)學(xué)科學(xué)研究提供參考。

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