武良美 張 雁 高鳳婷

(江蘇省南京市浦口區(qū)中心醫(yī)院病理科 211800)

病理切片制片為病理診斷的基礎(chǔ)工作，制片質(zhì)量高低直接影響到診斷的準(zhǔn)確與否，也反映了醫(yī)院的治療水平［1］。切片和染色為制片的主要內(nèi)容，其中，HE染色為組織標(biāo)本處理中最常用的染色方法，其制作簡(jiǎn)單，可得到染色穩(wěn)定、色彩鮮艷的制片，但也存在一定的問題如使用過程中褪色等。此類問題的出現(xiàn)與蘇木精與伊紅染色液的pH值不夠穩(wěn)定有關(guān)［2－3］。對(duì)染色前的切片進(jìn)行無水化處理可有效改善此類問題。本文現(xiàn)將無水化處理HE染色的主要內(nèi)容介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

結(jié)腸組織標(biāo)本(臨床科室送檢樣品);無水乙醇及95%乙醇(國藥集團(tuán)試劑廠，分析純);蘇木精及伊紅Y(化學(xué)純，上海善普化工科技有限公司);其他試劑為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑，均為分析純。蘇木精、伊紅染色液，酸性飽和硫酸鉀溶液，酸性移除溶液的配制參考文獻(xiàn)方法［4］。

1.2 組織處理及染色

1.2.1 組織處理將送檢結(jié)腸組織使用10%甲醛溶液固定，脫水、石蠟包埋，冷凍切片。切片厚度為4 μm，共80張切片。并隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各40張。使用二甲苯洗去石蠟、無水乙醇－95%乙醇梯度水化后將切片置于蒸餾水中備用。

1.2.2 蘇木精染色 將實(shí)驗(yàn)組切片從蒸餾水中取出，浸泡于酸性硫酸鉀飽和溶液中，使充分浸泡。滴入蘇木精染色液3 min。對(duì)照組切片自蒸餾水中取出后不經(jīng)酸性硫酸鉀飽和溶液浸泡直接蘇木精染色液3 min。

1.2.3 伊紅染色 實(shí)驗(yàn)組:從蘇木精染液中取出，蒸餾水沖洗5 s后直接置于3%碳酸氫鈉水溶液中，分別上下振動(dòng)3次，約5 s;蒸餾水沖洗20 s后置于酸性乙醇中，分別上下振動(dòng)3次，約5 s;采用伊紅染色液染色5 s，蒸餾水沖洗5 s。對(duì)照組:從蘇木精染液中取出，采用伊紅染色液染色5 s，蒸餾水沖洗5 s。兩組染色完成后采用無水乙醇 －95%乙醇梯度脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片待檢。

1.3 結(jié)果觀察染色完成后由兩名高年資病理醫(yī)生結(jié)合肉眼及顯微鏡(40倍)觀察染色結(jié)果，以染色鮮艷、色澤分明、對(duì)比清晰、無沉渣為切片染色效果較好。

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組切片著色較深，顏色鮮艷，色澤分明;對(duì)照組著色較淡，顏色不鮮艷，色澤不對(duì)不清晰。

2.2 顯微鏡觀察結(jié)果 觀察組:染色效果較好，鏡下可見細(xì)胞核為深藍(lán)色著色，且著色細(xì)膩;可明顯分辨核仁與核膜;細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核作色對(duì)比清晰，細(xì)胞質(zhì)為鮮紅色，細(xì)胞核為深藍(lán)色;未見蘇木精沉渣。對(duì)照組:切片染色效果較差，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)染色區(qū)分不清晰，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)為淡紅色;鏡下可見較多蘇木精沉渣。

3 討論

常規(guī)切片技術(shù)為病理技術(shù)中是一項(xiàng)既普通又極其重要的技術(shù)，所制得切片質(zhì)量的好壞將直接關(guān)系到臨床病理診斷的準(zhǔn)確性［5］。高質(zhì)量的病理切片可給診斷提供十分有利的幫助，相反，切片褪色、質(zhì)量不高等原因不僅耽誤診斷的及時(shí)性，還給患者帶來較大痛苦。因此，重視提高切片的質(zhì)量對(duì)于病理診斷具有十分重要的意義［6］。HE染色為最為常見的切片制片技術(shù)，其操作關(guān)鍵在于組織的固定、脫水、浸蠟與包埋等步驟的處理是否科學(xué)、合理，但實(shí)驗(yàn)室常見切片染色不均、切片褪色、蘇木精沉渣干擾診斷等因素均可對(duì)診斷造成干擾。如何提高病理組織HE染色切片的質(zhì)量已經(jīng)成為病理診斷的研究熱點(diǎn)［7］。

常規(guī)HE染色中，精處理后的切片置入蘇木精染色液后，由于切片自身攜帶的水分及空氣中水分的酸堿度高于蘇木精染色液的酸堿度，導(dǎo)致蘇木精染色液的pH值逐漸升高，致使染色液中的堿性氫氧根離子增多。持續(xù)增多的堿性氫氧根離子可與蘇木精染色液中的Al3+結(jié)合生產(chǎn)氫氧化鋁，導(dǎo)致染色液中游離的Al3+減少，導(dǎo)致蘇木紅的數(shù)量減少、細(xì)胞核染色染色較淡的發(fā)生。另外，持續(xù)增加的pH值可抑制蘇木精與細(xì)胞核的結(jié)合力，也促使細(xì)胞核染色不清晰的發(fā)生;較高的酸堿度導(dǎo)致伊紅的酸堿度高于細(xì)胞質(zhì)的等電點(diǎn)，促使伊紅染色液與細(xì)胞質(zhì)分離，導(dǎo)致染色不清晰，最終導(dǎo)致對(duì)診斷造成干擾［8］。

針對(duì)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的上述問題，筆者分析對(duì)組織切片進(jìn)行無水化處理后再染色可有效改善切片的質(zhì)量。為此，在蘇木精染色階段，將組織切片充分浸泡于酸性硫酸鉀飽和溶液中，其酸堿度與蘇木精染色液相當(dāng)，不感染染色，可使組織切片充分脫水后染色;伊紅染色階段，將組織切片使用蒸餾水沖洗5 s后直接置于3%碳酸氫鈉水溶液和置于酸性乙醇中，酸性乙醇取代了外來的水分，為有效抑制水分的滲入提供了保證，均為進(jìn)行無水化處理的關(guān)鍵步驟。本文實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)無水化處理后，組織切片HE染色的質(zhì)量明顯提高，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

［1］王小曉.水溶性伊紅Y不同配置法對(duì)HE染色效果的影響［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2013，29(5):575－576.

［2］朱憶凌，龔偉，周新木，等.細(xì)胞學(xué)涂片HE染色后直接行免疫組化染色分析［J］.現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué)，2012，24(8):876－877.

［3］劉海芳.HE染色切片褪色后免疫組化染色方法研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2011，49(17):81 －82.

［4］王力，曹加興，李濤，等.無水化處理在病理組織HE染色中的應(yīng)用研究［J］.西南國防醫(yī)藥，2013，23(10):1045－1047.

［5］王法娟.高碘對(duì)大鼠下腔靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活化的影響［D］.山東大學(xué)，2012.

［6］王建民.淺析病理技術(shù) HE染色在病理診斷中的應(yīng)用措施［J］.醫(yī)藥前沿，2013，(6):306.

［7］唐從國，郭周慶.如何做好一張HE染色切片［J］.中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2012，21(4):428－429.

［8］劉勇，袁晟.采用組織芯片技術(shù)進(jìn)行蘇木精 －伊紅(HE)染色技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的研究［J］.實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2012，30(1):19 －20，95.