吳海偉，賈燕花，王曉青，高 磊，薛謨斐，劉皈陽

0 引言

復方氯霉素醇溶液是《中國人民解放軍醫(yī)療機構制劑規(guī)范》[1](2002年增補版)(以下簡稱“軍隊制劑規(guī)范”)中收載的一種外用制劑，具有抗菌、軟化角質(zhì)作用，臨床上主要用于治療脂溢性皮炎、皮疹、瘙癢癥等。復方氯霉素醇溶液中含有氯霉素、水楊酸兩種主成分，用75%乙醇作為溶劑配制而成。在《軍隊制劑規(guī)范》中，采用了高效液相法和中和滴定法分別測定復方氯霉素醇溶液中氯霉素、水楊酸的含量，該方法操作較繁瑣、耗時；因此，為了簡化復方氯霉素醇溶液中氯霉素、水楊酸的含量測定方法，提高專屬性、準確性；本實驗擬建立高效液相法同時測定復方氯霉素醇溶液中氯霉素、水楊酸的含量，參考2010版《中國藥典》[2]進行方法學驗證，結果，該方法能夠較準確地測量復方氯霉素醇溶液的含量，為該制劑的質(zhì)量標準控制提供了參考。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器 Aglient1200型高效液相色譜儀，Eclips XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱，美國Aglient公司；紫外分光光度儀，U-3000，日本日立株式會社；電子天平，Mettler AE200，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 試藥 氯霉素對照品(批號：100508-200902，中國藥品生物制品鑒定所)，水楊酸對照品(批號：100106-201104，中國藥品生物制品鑒定所)，氯霉素原料藥(批號：CH130313，南京白敬宇制藥有限責任公司)，水楊酸原料藥(批號：10092，山東新華制藥股份有限公司)，乙酸(分析純，北京化工廠)，甲醇(色譜級，賽默飛世爾科技有限公司)，復方氯霉素醇溶液(本院自制，批號：130911-1、130911-2、130911-3，規(guī)格：100 mL/瓶)。

2 方法與結果

2.1 溶液配制

2.1.1 對照品液液的制備 稱取氯霉素對照品約50.0 mg，水楊酸對照品約50.0 mg，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，用適量甲醇溶解，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液；精密量取5 mL置于50 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即為對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取復方氯霉素醇溶液2.5 mL，置于50 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，再精密量取5 mL置于50 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.1.3 空白溶液的制備 根據(jù)處方比例，配制不含氯霉素、水楊酸的空白樣品，并按“2.1.2”項配制空白溶液。

2.2 最大吸收波長的確定 稱取等量氯霉素、水楊酸對照品適量，用適量甲醇溶解，流動相稀釋成適當濃度，在紫外分光光度儀下，400～200 nm范圍內(nèi)進行全波長掃描，結果，氯霉素與水楊酸混合溶液在293.2 nm處有最大吸收值(見圖1)；因此，檢測波長確定為293 nm。

2.3 色譜條件 色譜柱為Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；以1%冰醋酸-甲醇(60∶40)為流動相；檢測波長為293 nm；流速1.0 mL/min，進樣量10 μL。

圖1 氯霉素、水楊酸混合溶液全波長掃描

2.4 專屬性試驗 取本品制劑2.5 mL，置于50 mL容量瓶中，共3份；分別加入10 mL 1 mol/L HCl溶液、10 mL 1 mol/L NaOH溶液及10 mL雙氧水，室溫放置60 h，用流動相稀釋至刻度，搖勻；精密量取適量，用流動相稀釋10倍，即為供試品溶液；分別取上述供試品溶液、對照品溶液及空白溶液10 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖。結果，該制劑在酸、堿及氧化條件下，均有雜質(zhì)峰出現(xiàn)，但均不干擾主峰，且兩主峰分離較好，分離度大于2，如圖2所示。

2.5 線性關系考察 精密量取對照品貯備液3、4、5、6、7、8 mL置于50 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，分別進樣10 μL以對照品峰面積(A)對濃度(C)進行線性回歸，氯霉素、水楊酸線性回歸方程分別為：A=14.42C-2.101,r=1；A=11.97C-53.21,r=1。表明氯霉素、水楊酸在60～160 μg/mL濃度范圍內(nèi)峰面積與濃度線性關系良好。

2.6 樣品測定

2.6.1 精密度試驗 精密量取對照品貯備液2.5 mL，置25 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻；取上述溶液10 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，計算得氯霉素峰面積RSD值為0.11%(n=6)，水楊酸峰面積RSD值為0.08%(n=6)；表明儀器精密度良好。

2.6.2 穩(wěn)定性試驗 按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，于室溫下放置24 h，每隔2 h進樣一次，每次進樣10 μL，記錄色譜圖，計算氯霉素、水楊酸峰面積的RSD值分別為0.12%、0.10%；表明本溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定，其峰面積基本不變。

2.6.3 重復性實驗 選擇同一批復方氯霉素醇溶液，按“2.1.2”項下方法制備6份供試品溶液，分別取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算得氯霉素峰面積RSD值為0.80%(n=6)，水楊酸峰面積RSD值為0.34%(n=6)；表明樣品含量測定重復性較好。

圖2 對照品及樣品高效液相色譜圖

2.6.4 加樣回收率試驗 稱取氯霉素、水楊酸原料藥各約40、50、60 mg，精密稱定，分別置50 mL容量瓶中，按處方比例加入輔料，適量甲醇溶解，加流動相稀釋至刻度，搖勻，再精密量取2.5 mL溶液，置于25 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，即制得濃度為80%、100%、120%的供試品溶液，每個濃度組制備3份。按“2.3”項下色譜條件，分別進樣，記錄色譜圖；結果氯霉素平均回收率為99.45%，RSD值為0.46%，水楊酸平均回收率為100.32%，RSD值為0.97%。結果見表1、表2。

2.7 耐用性考察 為考察該色譜條件對測定結果的影響，擬在改變下列色譜條件的情況下，對供試品進行含量測定，并計算每個條件下含量測定的RSD值。(1)改變流速±0.2 mL/min：0.8 mL/min；1.0 mL/min；1.2 mL/min。(2) 改變流動相比例±2%：1%冰醋酸∶甲醇=58∶42；1%冰醋酸∶甲醇=60∶40；1%冰醋酸∶甲醇=62∶38。(3)改變波長±5 nm：288 nm；293 nm；298 nm。(4)色譜柱：①Eclipse plus-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。②ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；③Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)

表1 氯霉素

表2 水楊酸

取復方氯霉素醇溶液，按“2.1.2”項下方法制備供試液，在上述色譜條件，進樣10 μL，記錄色譜圖。試驗結果表明：在改變流動相比例、流速、波長及色譜柱條件下，供試品的測定含量均符合要求，各條件下含量測定的RSD值均小于2%，說明該方法用于樣品含量測定，耐用性較好。結果見表3。

2.8 樣品含量測定 取復方氯霉素醇溶液三批(批號：130911-1、130911-2、130911-3)，按“2.1.2”項下方法制備供試液，取10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法計算含量，測定3批樣品中氯霉素含量分別為98.52%、99.76%、98.92%，水楊酸的含量分別為99.06%、100.97%、99.27%。結果表明：三批樣品中氯霉素和水楊酸的含量均符合要求，結果見表4。

表3 耐用性試驗結果

表4 樣品含量測定結果

3 討論

本實驗建立高效液相法同時測定復方氯霉素醇溶液中氯霉素、水楊酸的含量，該方法簡單、方便，避免了《軍隊制劑規(guī)范》中分別測定水楊酸、氯霉素含量的繁瑣步驟。該方法與《軍隊制劑規(guī)范》中氯霉素含量測定項下色譜條件相比，流動相配制更簡單，對主成分出峰時間影響較小，提高了含量測定的準確度。另外，有文獻報道[3-5]，HPLC法同時測定復方氯霉素醇溶液中氯霉素和水楊酸的含量，采取單一檢測波長，例如278 nm，但水楊酸的最大吸收波長為301 nm(經(jīng)紫外分光光度儀檢測)，在278 nm處氯霉素與水楊酸的吸收強度差別較大，不適合作為兩者的共同檢測波長；也有文獻報道[6]，采用雙波長雙通道法檢測該制劑中氯霉素和水楊酸的含量，即在278和300 nm處分別檢測氯霉素和水楊酸的色譜峰；而王敏等[7]人采用了單波長切換的方法測定復方氯霉素醇溶液的含量，但考慮基層設備條件問題，均不適合作為制劑標準規(guī)范收載。因此，本實驗選取氯霉素、水楊酸混合液的最大吸收波長293 nm，作為本品制劑含量測定的檢測波長；在293 nm處，氯霉素與水楊酸的吸收值相近，能同時滿足兩者檢測的需要，有利于提高含量測定的靈敏度和準確度。本方法應用于復方氯霉素醇溶液的含量測定，并做了重復性、耐用性等試驗的考察，結果均較好，可用于該制劑質(zhì)量的控制。

參考文獻：

[1] 中國人民解放軍總后勤部編.中國人民解放軍醫(yī)療機構制劑規(guī)范2002年版增補本[M].人民軍醫(yī)出版社,2007:28-29.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄XIXA.

[3] 郭勝才,谷娜,李華.高效液相色譜法測定復方氯霉素醇溶液中水楊酸與氯霉素含量[J].醫(yī)藥導報,2010,29(6):783-785.

[4] 劉晉華,李玉萍,尤光甫.復方氯霉素醇溶液含量測定方法的改進[J].解放軍藥學學報,2007(3):228-230.

[5] 陶建亮,張崇生.高效液相色譜法測定復方氯霉素醇溶液的含量[J].海峽藥學,2006,18(4):87-88.

[6] 谷娜,邢旺興,郭勝才.高效液相色譜法同時測定復方氯霉素醇溶液中水楊酸與氯霉素含量[J].健康研究,2009,29(3):177-179.

[7] 王敏,張瑞麟,王逢春,等.高效液相色譜法單波長切換測定復方氯霉素醇溶液中水楊酸、氯霉素含量[J].解放軍醫(yī)藥雜志,2013(8):94-96.