譚 紅，鄧婷婷，聶敏海

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔內(nèi)科，瀘州醫(yī)學(xué)院口頜面修復(fù)重建和再生實(shí)驗(yàn)室，四川 瀘州 646000)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是最常見的口腔惡性腫瘤，每年有超過27萬(wàn)人發(fā)病，是威脅人類健康的主要疾病之一，原位侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響其預(yù)后的重要因素。阻止癌前病變突破基底膜轉(zhuǎn)化為浸潤(rùn)癌，是OSCC早期防治的關(guān)鍵。近年來，有關(guān)上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的信息不斷涌現(xiàn)，認(rèn)為EMT在腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程中扮演了重要角色，促使研究者們研究并分析EMT在OSCC發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機(jī)制。本文對(duì)EMT的分子機(jī)制、與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其調(diào)控OSCC侵襲轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展作一綜述。

1 一般分子機(jī)制

1.1 EMT的概念 EMT是指具有極性的上皮細(xì)胞向具有運(yùn)動(dòng)能力的間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)換并獲得遷移和侵襲能力的過程，涉及多種調(diào)控分子和復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，與動(dòng)物的多個(gè)生理和病理過程相關(guān)。細(xì)胞經(jīng)歷EMT后發(fā)生一系列生物學(xué)改變，包括細(xì)胞極性消失、細(xì)胞間連接喪失、細(xì)胞游走或散在分布、上皮標(biāo)志物缺失而間充質(zhì)標(biāo)志物重新表達(dá)等［1］。間充質(zhì)細(xì)胞也可以逆向轉(zhuǎn)化為上皮細(xì)胞即間充質(zhì)-上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換(mesenchymal-epithelialtransition，MET)。EMT和MET表現(xiàn)為動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化過程，胚胎發(fā)育過程中EMT產(chǎn)生的間充質(zhì)細(xì)胞可以重新轉(zhuǎn)化為上皮細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生的MET可能與胚胎發(fā)育過程中的MET過程類似。

1.2 EMT的分型 依據(jù)EMT的發(fā)生背景、生物學(xué)行為和標(biāo)志物不同將其分為3型。Ⅰ型:胚胎發(fā)育和組織分化過程中的EMT;Ⅱ型:傷口愈合、組織再生、器官纖維化中的EMT;Ⅲ型:腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲過程中的EMT。對(duì)于Ⅲ型EMT，癌細(xì)胞經(jīng)歷EMT后并不完全轉(zhuǎn)化成間充質(zhì)細(xì)胞，而是具有部分EMT特性，包括上皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)降低、間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)增高、基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)亢進(jìn)等，細(xì)胞表現(xiàn)為低分化形態(tài)，具有浸潤(rùn)性強(qiáng)、惡性程度高的生物學(xué)特性［2］。大量研究證實(shí)EMT參與癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過程，癌標(biāo)本中EMT的多個(gè)標(biāo)志物與腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率增高以及成活率下降相關(guān)。然而，只有腫瘤進(jìn)展前沿的某些癌細(xì)胞經(jīng)歷EMT，其他癌細(xì)胞仍然保留其上皮性狀。

1.3 EMT相關(guān)分子 參與EMT的分子包括區(qū)分上皮細(xì)胞與間充質(zhì)細(xì)胞的特定標(biāo)記物和可使細(xì)胞轉(zhuǎn)向間充質(zhì)細(xì)胞或上皮細(xì)胞狀態(tài)的調(diào)控者。細(xì)胞經(jīng)歷EMT通常表現(xiàn)出波形蛋白、N-鈣粘蛋白、纖連蛋白及整合素 αvβ6表達(dá)增加;E-鈣粘蛋白、橋粒斑蛋白、細(xì)胞角蛋白和occludin表達(dá)減少［3］。下面介紹最近研究報(bào)道的調(diào)控代表分子:E-鈣粘素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)、轉(zhuǎn)錄抑制因子及 miRs。

1.3.1 E-鈣粘素 E-鈣粘素是一種鈣依賴性跨膜糖蛋白，表達(dá)于大多數(shù)上皮組織，構(gòu)建相鄰細(xì)胞間的黏附連接，被認(rèn)為是EMT的一個(gè)“主調(diào)節(jié)器”。EMT的一個(gè)特征性表現(xiàn)是細(xì)胞與細(xì)胞間粘附缺失并伴有E-鈣粘素表達(dá)減弱或缺失，其缺失可導(dǎo)致人類多種惡性腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移。EMT引發(fā)的細(xì)胞間粘附缺失和隨后的由整合素(如 β4，α5β1，αVβ6)介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)粘連是癌癥進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的第一個(gè)關(guān)鍵步驟［4］。腫瘤細(xì)胞E-鈣粘素表達(dá)缺失和患者預(yù)后不良相關(guān)。在上皮性腫瘤進(jìn)展過程中許多因素導(dǎo)致了E-鈣粘素表達(dá)/功能喪失，這些因素包括:E-鈣粘素的DNA甲基化、E-鈣粘素基因突變、染色體畸變、生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)激活轉(zhuǎn)錄抑制物抑制E-鈣粘素轉(zhuǎn)錄、E-鈣粘素被蛋白酶降解［5］。

1.3.2 TGF-β信號(hào) 多種生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)E-鈣粘素表達(dá)/功能缺失，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲，包括TGF-β、IL-6、HGF 及其受體 Met、EGF、IGF、FGF 等。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β誘導(dǎo)EMT，使E-鈣粘素的DNA甲基化增加，阻止E-鈣粘素基因轉(zhuǎn)錄;撤消TGF-β，E-鈣粘素重新表達(dá)促進(jìn)EMT過程逆轉(zhuǎn)［6］。TGF-β與EMT相關(guān)的其它信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制包括激活SMA和Smad蛋白質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和TGF-β自分泌，進(jìn)一步增強(qiáng)EMT過程，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和PI3K/Akt途徑依賴于Smad的激活。TGF-β還激活整合素、Notch和 Wnt信號(hào)通路，觸發(fā) EMT發(fā)生［7］。TGF-β受體表達(dá)不足的小鼠皮膚和結(jié)腸癌模型預(yù)后較好。

1.3.3 轉(zhuǎn)錄因子 幾個(gè)轉(zhuǎn)錄抑制因子家族調(diào)控EMT，包括鋅指蛋白Snail1和Snail2、兩手鋅指δEF1家族因子(δEF1/Zeb1和SIP1/Zeb2)以及螺旋-環(huán)-螺旋因子Twist和E12/E47［8］。信號(hào)通路如TGF-β、Wnt信號(hào)級(jí)聯(lián)和PI3K/AKT軸與這些轉(zhuǎn)錄抑制因子有關(guān)。這些抑制因子與E-鈣粘素基因啟動(dòng)子結(jié)合后導(dǎo)致多種E-鈣粘素表達(dá)的表觀遺傳沉默。例如，Snail可通過三條途徑抑制E-鈣粘素表達(dá):①誘導(dǎo)激活組蛋白脫乙酰基酶，以除去組蛋白的乙酰基，導(dǎo)致組蛋白和DNA高親和力結(jié)合，從而阻止E-鈣粘素基因轉(zhuǎn)錄;②組蛋白去乙?；€可增強(qiáng)多梳抑制復(fù)合物2和DNA之間的結(jié)合，引起DNA甲基化，從而抑制 E-鈣粘素基因的轉(zhuǎn)錄［9］;③此外，Snail可上調(diào)ZEB1表達(dá)，進(jìn)一步抑制E-鈣粘素表達(dá)。與Snail對(duì)E-鈣粘素表達(dá)的抑制作用一致，E-鈣粘素表達(dá)與Snail之間的負(fù)相關(guān)性已在OSCC患者中得到證實(shí)［10］。

1.3.4 miRNAs 最近研究發(fā)現(xiàn)，特殊的微型核糖核酸(miRs或 miRNAs)調(diào)控著 EMT，如 ZEB1和ZEB2通過miR-200(miRNA-200)家族的調(diào)節(jié)，miR-200缺失可導(dǎo)致EMT。其它調(diào)節(jié)ZEB1/2的miRNA包括 miR-205 和 miR-192/215［11］。調(diào)節(jié) Snail1 或Snail2 的 miRNA 包括 miR-1、miR-29b、miR-30c、miR-34和miR-203［12］。其它與 EMT相關(guān)參與蛋白質(zhì)翻譯的基因包括:Y型盒結(jié)合蛋白1(YB-1)和異質(zhì)核核糖核蛋白E1(hnRNP E1)。此外，EMT通過下調(diào)上皮剪接調(diào)控蛋白1和2(ESRP1和ESRP2)在基因轉(zhuǎn)錄的選擇性剪接中啟動(dòng)廣泛變化［13］。

2 EMT 與腫瘤轉(zhuǎn)移

遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是癌癥發(fā)展的最后階段，并為癌癥相關(guān)死亡的主要原因。該過程由多個(gè)步驟組成，腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位逸出后侵入腫瘤基質(zhì)，并通過內(nèi)滲直接進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴系統(tǒng);失巢凋亡的環(huán)境使大多數(shù)循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞凋亡，如果腫瘤細(xì)胞生存，它們可以粘貼到內(nèi)皮細(xì)胞并從循環(huán)外滲到周圍組織中到達(dá)更合適的位點(diǎn);最后，腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處定植生長(zhǎng)在新的環(huán)境［8］。癌細(xì)胞經(jīng)歷EMT后能夠獲得侵入性并進(jìn)入周圍間質(zhì)，創(chuàng)造有利于腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的微環(huán)境。EMT與腫瘤發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥密切相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物模型和臨床病例分析的數(shù)據(jù)均支持EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。癌癥發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的EMT過程與在胚胎發(fā)育過程中觀察到的非常類似。在轉(zhuǎn)移性腫瘤形成的早期階段，癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)移部位必須經(jīng)過反向轉(zhuǎn)化即MET，使轉(zhuǎn)移腫瘤的主要病理特征與原發(fā)腫瘤一致。研究發(fā)現(xiàn)，去除EMT的誘導(dǎo)劑如TGF-β，建立缺氧環(huán)境在體外可觀察到MET。相似的過程也發(fā)生在轉(zhuǎn)移部位，需要癌癥細(xì)胞重新表達(dá)E-鈣粘素用于細(xì)胞黏附［14］。

2.1 EMT與腫瘤干細(xì)胞 越來越多的證據(jù)支持假說:大多數(shù)腫瘤含有細(xì)胞亞群，通常稱其為腫瘤起始細(xì)胞或“腫瘤干細(xì)胞”，它們具有自我更新和重新生成腫瘤中所有類型細(xì)胞的能力［15］。這些腫瘤干細(xì)胞也表達(dá)EMT標(biāo)志物，可以通過其特定的細(xì)胞表面和其他標(biāo)記物從腫瘤細(xì)胞中分離。此外，誘導(dǎo)永生化的人乳腺上皮細(xì)胞經(jīng)歷EMT，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞也獲得與干細(xì)胞相關(guān)的特征，如表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物，形成微球體的能力增加［16］。研究發(fā)現(xiàn)EMT表型的細(xì)胞是腫瘤干細(xì)胞的豐富來源，EMT和腫瘤干細(xì)胞之間存在著生物學(xué)聯(lián)系［17］。部分研究者認(rèn)為癌癥EMT和腫瘤干細(xì)胞理論可能是一致的，腫瘤干細(xì)胞部分通過與EMT相關(guān)的過程獲得轉(zhuǎn)移能力。

2.2 EMT與腫瘤微環(huán)境 腫瘤微環(huán)境由細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、癌相關(guān)成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞及癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移需要的可溶性因子組成。腫瘤微環(huán)境中癌細(xì)胞間的相互作用可以通過介質(zhì)如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和ECM蛋白的自動(dòng)和/或旁分泌誘導(dǎo)EMT［18］。在乳腺癌細(xì)胞中，癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)物可以誘導(dǎo)EMT。在原發(fā)性大腸癌的侵襲前沿去分化的間葉細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)核β-連環(huán)蛋白表達(dá)。癌相關(guān)成纖維細(xì)胞可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞經(jīng)歷EMT。這些研究表明，腫瘤微環(huán)境可誘發(fā)或維持EMT［19］。同樣，OSCC 細(xì)胞可以通過 TGF-β 分泌直接誘導(dǎo)為肌成纖維細(xì)胞表型。TGF-β信號(hào)通過間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞可誘導(dǎo)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)分泌，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲。

3 EMT與OSCC侵襲和轉(zhuǎn)移

3.1 OSCC中的EMT OSCC因其侵襲性和高死亡率成為人類極具殺傷力的癌癥之一。細(xì)胞經(jīng)歷EMT后表現(xiàn)出多種上皮標(biāo)志物下調(diào)和間質(zhì)標(biāo)記物上調(diào)。最近的研究發(fā)現(xiàn)在OSCC細(xì)胞株中上皮細(xì)胞表型表現(xiàn)出E-鈣粘素和MMP-9下調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞表型表現(xiàn)出波形蛋白和MMP-2上調(diào)，波形蛋白表達(dá)于OSCC侵襲前沿癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。鈣粘蛋白轉(zhuǎn)換，即E-鈣粘素表達(dá)缺失而N-cadherin表達(dá)增加，是人類癌癥EMT的關(guān)鍵。Snail是EMT過程中調(diào)節(jié)E-鈣粘素蛋白的一個(gè)主要基因。在OSCC模型中，Snail轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表現(xiàn)出完全的EMT表型，呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣外觀，表達(dá)波形蛋白，E-鈣粘素轉(zhuǎn)換為N-鈣粘素以及半橋粒缺乏。此外，在這些細(xì)胞中ZEB-1和ZEB-2表達(dá)上調(diào)。在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌模型中，大多數(shù)病例N-cadherin高表達(dá)，且N-cadherin表達(dá)與惡性行為顯著相關(guān)［20］。

3.2 OSCC中EMT相關(guān)的信號(hào)通路

3.2.1 PI3K/Akt信號(hào)通路 PI3K/Akt信號(hào)通路的激活常見于包括OSCC在內(nèi)的人類癌癥，尤其是Akt-1和Akt-2過度表達(dá)于OSCC。PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活是OSCC中EMT的一個(gè)重要特征。為探討Akt蛋白在OSCC中的生物學(xué)作用，研究者培養(yǎng)OSCC細(xì)胞株設(shè)計(jì)激活A(yù)kt。結(jié)果發(fā)現(xiàn)OSCC細(xì)胞發(fā)生EMT，并伴有E-鈣粘素、橋粒斑蛋白、β-連環(huán)素下調(diào)和波形蛋白上調(diào)。形態(tài)上，口腔鱗癌細(xì)胞失去上皮特性而獲得成纖維細(xì)胞樣特性。此外，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中經(jīng)歷EMT的細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞-細(xì)胞間附著降低，運(yùn)動(dòng)性和侵襲性增加。當(dāng)Akt活性受到抑制，OSCC可發(fā)生MET及E-鈣粘素重新表達(dá)，從而恢復(fù)上皮特點(diǎn)［21］。這種現(xiàn)象是癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)移部位定植及適應(yīng)新的微環(huán)境的重要一步。Hong等［22］認(rèn)為，對(duì)于OSCC患者，Akt抑制劑是一種控制癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移很有前途的治療藥物。

3.2.2 TGFβ信號(hào)通路 在正常上皮細(xì)胞和細(xì)胞癌變的早期階段，TGF-β是一種抑癌基因，隨著癌變進(jìn)展，癌細(xì)胞可利用TGFβ作為一種有效的的致癌活化劑。TGFβ在發(fā)育和包括OSCC在內(nèi)的人類癌癥中誘導(dǎo) EMT。Qiao等［23］發(fā)現(xiàn)用重組 TGFβ1刺激OSCC細(xì)胞后，Slug和MMP-9表達(dá)上調(diào)，而Snail的表達(dá)上升和下降與OSCC細(xì)胞MMP-2表達(dá)一致。認(rèn)為Slug和 Snail是 TGFβ1觸發(fā) EMT的調(diào)控者。Richter等［24］研究發(fā)現(xiàn)在OSCC中EMT由多種生長(zhǎng)因子介導(dǎo)，包括EGF和TGFβ1。用EGF或TGF-β1處理OSCC細(xì)胞可刺激誘導(dǎo)表型轉(zhuǎn)化，其波形蛋白上調(diào)和E-cadherin下調(diào)，OSCC細(xì)胞顯示侵襲力增強(qiáng)并粘附到I-IV膠原蛋白。TGF-β和EGF在EMT中扮演著重要的角色，調(diào)節(jié)ECM降解和促進(jìn)OSCC發(fā)展。

3.2.3 Wnt/β-catenin信號(hào)通路 Wnt/β-catenin 信號(hào)通路是細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)生和EMT中的一個(gè)主要信號(hào)通路。β-連環(huán)蛋白在細(xì)胞質(zhì)的異常積累可誘導(dǎo)TCF/LEF-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活，上調(diào)MMP-7，從而誘導(dǎo)OSCC細(xì)胞發(fā)生 EMT，促進(jìn)侵襲和轉(zhuǎn)移［25］。Iamaroon等［26］發(fā)現(xiàn)在 OSCC中存在TGFβ信號(hào)通路異常，伴有Smad4蛋白表達(dá)減少或缺失。這些研究結(jié)果表明一些OSCC可能采用另一種信號(hào)途徑，如PI3K/Akt，MEK/ERK 或 Wnt 基因/β-連環(huán)蛋白途徑。

研究發(fā)現(xiàn)缺氧在EMT中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。缺氧的微環(huán)境對(duì)于任何腫瘤細(xì)胞都是很常見的，并能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄抑制劑的表達(dá)與活性水平觸發(fā)EMT。在舌鱗癌組織中，缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α，HIF-2α，Twist-2過度表達(dá)，且這些分子(HIF-2α的除外)的過量表達(dá)與更短的生存期相關(guān)［27］。HIF-1α、HIF-2α、Twist-2中的兩個(gè)以上的標(biāo)記物聯(lián)合表達(dá)對(duì)于舌鱗癌患者具有重要的預(yù)后預(yù)測(cè)作用。

4 展望

OSCC是一種破壞性疾病，目前仍是全球公共健康的一個(gè)主要威脅。研究EMT在腫瘤和OSCC中的作用及其機(jī)制，對(duì)闡明OSCC的生物學(xué)行為、尋找有效的治療方法和判定預(yù)后具有重要意義。

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