曹 瑞，程茜菲，李艷茸，何 瑞，曹林林(.陜西中醫(yī)學(xué)院，咸陽 7046；.陜西中醫(yī)學(xué)院制藥廠，咸陽 7083)

維血寧收錄于《中國藥典》中[1]，由虎杖、雞血藤、炒白芍、熟地黃、生地黃、墨旱蓮、仙鶴草、太子參八味藥組成，滋陰涼血，清熱涼血，作為臨床上常用的治療血小板、白細(xì)胞減少癥的復(fù)方中藥，其不良反應(yīng)小、治療效果好，善于預(yù)防，長于治本，而且還可以作為一種補血健身劑。目前，文獻(xiàn)報道大多是測定維血寧中虎杖苷、大黃素[2-4]、芍藥苷[5]的含量，未有對其指紋圖譜研究的報道。本文采用高效液相色譜法，以虎杖苷、大黃素、大黃素甲醚、大黃素-8-O-β-D葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷為對照品，建立了維血寧的指紋圖譜[6]，為維血寧的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 超聲清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司，型號SB-3200D，180 W，40 kHz)；HC.TPII.S普通藥物天平(濟(jì)南市醫(yī)療器械廠)；電子分析天平(瑞士薩多利斯)；高效液相色譜儀(Waters2695-2996)，Empower色譜工作站；梅特勒GB204電子天平(萬分之一)。

1.2 試藥 虎杖苷(中國藥品生物制品檢定所，批號111575-200502)；大黃素甲醚(中國藥品生物制品檢定所，批號758-9904)；大黃素(中國藥品生物制品檢定所，批號0756-9505)；大黃素-8-O-β-D葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷(由本實驗室自制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.3%)；維血寧(由陜西中醫(yī)學(xué)院制藥廠提供，批號111001，110702，110801，110802，110901，110902，110903，111002，111201，111202)。色譜乙腈、甲醇(Fisher公司)；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Accurasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長：280 nm；進(jìn)樣量：10 μL；分析時間：90 min。流動相：A(乙腈)-B(1 mL·L-1磷酸水)梯度洗脫，洗脫梯度0～12 min(98%B)、12～30 min(98%～80%B)、30～35 min(80%～75%B)、35～40 min(75%～73%B)、50～60 min(65%～52%B)、 60～70 min(52%～10%B)、70～75 min(10%B)、75～83 min(10%～97%B)。

2.2 溶液的制備 供試品溶液的制備：精密量取樣品2.0 mL，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)80%甲醇定容，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

混合對照品溶液的制備：精密稱取各對照品適量，加甲醇分別制成每毫升含虎杖苷0.036 mg、大黃素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷0.055 mg、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷0.193 mg、大黃素甲醚0.094 mg、大黃素0.107 mg的溶液，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實驗 取同一供試品溶液，按2. 1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以虎杖苷為參照峰，計算相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果表明，5個共有峰相對保留時間RSD為0.018%～0.06%，相對峰面積RSD為0.23%～0.65%，RSD均小于3%，表明儀器的精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性實驗 取2.2項下供試品溶液，分別于0，2，4，8，12和24 h進(jìn)樣10 μL進(jìn)行分析。以虎杖苷為參照峰，計算相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果相對保留時間的RSD為0.02%～1.78%，相對峰面積的RSD為 0.033%～1.15%，RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性實驗 取同一批號樣品(111001)，分別精密稱取6份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以虎杖苷為參照峰，計算相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果表明，相對保留時間RSD為0.023%～1.79%，相對峰面積RSD為0.50%～1.14%，RSD均小于3%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 回收率實驗 精密吸取6份已知含量的維血寧(批號：111101)2.0 mL，分別精密加入虎杖苷溶液0.439 mg、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷0.361 mg，大黃素甲醚0.214 mg、大黃素0.322 mg和大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷0.54 mg，按2.1項下的色譜條件進(jìn)行測定，計算回收率、RSD值，結(jié)果見表1。

表1 回收率實驗結(jié)果

2.4 指紋圖譜的建立和相似度分析

2.4.1 指紋圖譜的建立及共有峰的標(biāo)定 取10批維血寧(批號111001，110702，110801，110802，110901，110902，110903，111002，111201，111202)，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項色譜條件進(jìn)行HPLC分析，建立指紋圖譜。通過應(yīng)用同樣的色譜條件，進(jìn)行了對照品的分析，通過對比對照品和樣品的HPLC色譜圖和紫外光譜圖；并通過色譜圖中的保留時間，最終確認(rèn)1號峰為虎杖苷所對應(yīng)的峰，2號峰為大黃素-8-O-β-D葡萄糖苷所對應(yīng)的峰，3號峰為大黃素所對應(yīng)的峰，4號峰為大黃素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷所對應(yīng)的峰，5號峰為大黃素甲醚所對應(yīng)的峰。

色譜圖見圖1。

圖1 10批維血寧樣品的指紋圖譜

2.4.2 共有峰的相對峰面積和相對保留時間 比較10批樣品的HPLC色譜圖，共標(biāo)定5個特征峰(圖1)，選取1號峰作為參照峰，保留時間與峰面積為1，計算其他各峰的相對保留時間及相對峰面積，結(jié)果5個共有峰相對保留時間RSD為0.06%～0.1%，各批號共有峰保留時間基本一致；5個共有峰相對峰面積RSD值均小于3%，說明各批號維血寧成分含量均一、穩(wěn)定。

2.4.3 對照指紋圖譜 10批維血寧經(jīng)《國家藥典》的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)計算生成其對照指紋圖譜，結(jié)果見圖2。

圖2 對照指紋圖譜

2.4.4 相似度計算 將10批維血寧指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入國家藥典委員會的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A版) ”設(shè)定匹配模板，進(jìn)行譜峰自動匹配，生成對照指紋圖譜，進(jìn)行相似度評價，相似度分別為:0.979，0.971，0.973，0.996，0.993，0.991，0.973，0.984，0.989和0.989。表明10批樣品與對照指紋圖譜相似度良好，對照圖譜可作為維血寧的指紋圖譜。

3 討論

經(jīng)采用全波長掃描，結(jié)果280 nm譜峰數(shù)目較多，各色譜峰的表觀豐度適中，同時比較了甲醇-水、乙腈-水以及乙腈-磷酸水系統(tǒng)，結(jié)果表明乙腈-1 mL·L-1磷酸水系統(tǒng)各色譜峰峰形好，分離效果最佳。結(jié)果采用乙腈-1 mL·L-1磷酸水為流動相，280 nm為測定波長。

本文通過HPLC測定10批維血寧，建立了維血寧的指紋圖譜，并采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A)”評價10 批維血寧的指紋圖譜整體相似度，結(jié)果10批樣品指紋圖譜的相似度均大于0.97。共指認(rèn)了5 個化學(xué)成分，分別為虎杖苷、大黃素、大黃素甲醚、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷。本文所建立的HPLC指紋圖譜可指導(dǎo)維血寧“譜-效”的構(gòu)建，也為維血寧質(zhì)量評價提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國家藥典委員會.中國藥典2010年版[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:1141.

[2] 李建忠，朱文學(xué).維血寧顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中國藥業(yè)，2005:14(5)，41-42.

[3] 楊懷武，王碧輝.維血寧顆粒(無糖型)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[J].中國藥師，2010，10(13):1528-1529.

[4] 顧崢嶸，承晨.HPLC法測定維血寧顆粒中大黃素的含量[J].江蘇藥學(xué)與臨床研究，2005，4(13):27-29.

[5] 朱洪敏，金藝，李晶，等.RP-HPLC法同時測定維血寧顆粒中芍藥苷、虎杖苷、麥角甾苷和白藜蘆醇的含量[J].藥物分析雜志，2009，29(6):905-908.

[6] 趙穎，李文，李鵬，等.鼠曲草飲片的RP-HPLC指紋圖譜研究[J].中國藥房，2013，15(24)：1392-1393.