汪 耀，王養(yǎng)正，Changqing Lee，肖湘華，楊 華，劉先寧，安 娜，朱娟莉，朱秀萍 (.陜西省眼科研究所，西安市第一醫(yī)院，陜西省眼科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 7000；.美國(guó)Prairie制藥公司，馬里蘭州貝塞斯達(dá) 080)

糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid, GC)以其強(qiáng)大的抗炎和免疫抑制作用成為治療各種炎癥和變態(tài)性疾病的一線藥物。但部分患者對(duì)其治療反應(yīng)較差，臨床上稱之為糖皮質(zhì)激素抵抗(glucocorticoid resistant, GR)。目前提出或者研究多種方法來(lái)逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素抵抗，比如P38 MAPK抑制劑、JNK抑制劑、組蛋白脫乙酰-2活化劑、茶堿、抗氧化劑、iNOS抑制劑和P-糖蛋白抑制劑[1-2]。孕激素類藥17α-己酸羥孕酮(17α-hydroxyprogesterone caproate, 17HPC)單用時(shí)可用于治療習(xí)慣性流產(chǎn)、月經(jīng)不調(diào)、子宮內(nèi)膜異位癥、功能性子宮出血等，用于逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素抵抗的可能是一種新的用途。本研究旨在經(jīng)不同濃度IL-2/4刺激，建立人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)對(duì)地塞米松(dexamethasone, DEX)抵抗的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，探討孕激素逆轉(zhuǎn)外周血單個(gè)核細(xì)胞對(duì)糖皮質(zhì)激素抵抗的作用。

1 儀器、材料和方法

1.1 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱(NU-4950，美國(guó)NuAire公司)；離心機(jī)(5810 R，德國(guó)Eppendorf公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo Scientific Multiskan MK3，美國(guó)熱電公司)。

1.2 材料 17HPC、DEX、植物血凝素(phytohemagglutinin, PHA)、二甲亞砜(DMSO)購(gòu)于Sigma 公司(美國(guó))；重組IL-2和IL-4購(gòu)于PeproTech(美國(guó))，PRMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)于HyClone(北京)。PBMC分離系統(tǒng)：Accuspin系統(tǒng)-Histopaque，購(gòu)于GE Healthare Bio-Science AB(美國(guó))；人的IL-2免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)測(cè)定試劑盒為上海Excell Biology公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 PBMC的分離與培養(yǎng) 抽取空腹男性健康志愿者外周血15 mL，置于含有肝素鈉的離心管中，使用Accuspin系統(tǒng)-Histopaque分離獲得PBMC。方法：將外周血緩慢加入等體積的淋巴細(xì)胞分離液中，在20 ℃下，以2 500 r·min-1離心30 min；吸取中間白膜層即為PBMC。重新懸浮于4 倍體積的RPMI 1640，在20℃下，以1 000 r·min-1離心10 min，洗滌3次。沉淀的細(xì)胞用1640完全培養(yǎng)基懸浮后計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/mL，加入96孔板培養(yǎng)。

1.3.2 測(cè)定DEX對(duì)PHA誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生IL-2的抑制作用 將PBMC(106/mL)鋪板在96孔板中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2下培養(yǎng)，設(shè)空白組和不同濃度DEX(10-12～10-5mol·L-1)組刺激1 h，接著用植物血凝素(phytohemagglutinin, PHA) 15 μg·mL-1刺激24 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，以2 000r·min-1離心10 min后，收集上清，用ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)IL-2含量，每組檢測(cè)2個(gè)復(fù)孔。酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)、550 nm校正來(lái)測(cè)定A值。IL-2水平用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。IL-2檢出限為4.0 pg·mL-1。

1.3.3 IL2和IL-4刺激細(xì)胞誘導(dǎo)其對(duì)地塞米松抵抗的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建[3-5]將PBMC(106/mL)鋪板在96孔板中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2下培養(yǎng)，設(shè)空白組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組用IL-2(13ng·mL-1)和IL-4(6.5 ng·mL-1)共同刺激，培養(yǎng)48 h，接著實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的DEX(10-10, 10-8和10-6mol·L-1)繼續(xù)培養(yǎng)1 h，然后所有組別再用PHA(15 μg·mL-1)刺激24 h，ELISA測(cè)定IL-2濃度，計(jì)算地塞米松對(duì)PHA誘導(dǎo)生成的IL-2的抑制率。抑制率(%)=1-(有地塞米松時(shí)PBMC產(chǎn)生的IL-2/無(wú)地塞米松時(shí)PBMC產(chǎn)生的IL-2)×100%

1.3.4 17HPC對(duì)IL2和IL-4刺激細(xì)胞誘導(dǎo)DEX抵抗的逆轉(zhuǎn)作用 將PBMC(106/mL)鋪板在96孔板中，用17HPC(10-11～10-5mol·L-1)刺激12 h，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)下，其中陰性對(duì)照組不用IL-2和IL-4刺激，其余實(shí)驗(yàn)組用IL-2(13 ng·mL-1)和IL-4(6.5 ng·mL-1)共同刺激，培養(yǎng)48 h；接著實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的DEX(10-12～10-6mol·L-1)1 h，所有組別用PHA(15 μg·mL-1)刺激24 h，ELISA測(cè)定IL-2的質(zhì)量濃度，計(jì)算17HPC單獨(dú)以及17HPC與DEX合用時(shí)，對(duì)PHA刺激產(chǎn)生的IL-2的抑制率(%)。將來(lái)自陰性對(duì)照(細(xì)胞+PHA，無(wú)任何藥物處理)的值設(shè)定為0%，所有其他的抑制率以公式計(jì)算：抑制率(%)=1-(藥物處理的PBMC產(chǎn)生的IL-2/陰性對(duì)照組PBMC產(chǎn)生的IL-2) ×100%。IC50(半數(shù)抑制濃度)的值采用GraphPad Prism 5.0應(yīng)用軟件處理計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 DEX對(duì)PHA誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生IL-2的抑制作用 DEX對(duì)PHA誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生IL-2的抑制作用，呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性，見(jiàn)圖1。PBMC分泌的IL-2水平，不用PHA刺激時(shí)為19±25 pg·mL-1(n=11)；PHA(15 μg·mL-1)刺激后，為677±447 pg·mL-1(n=20)；PHA(15 μg·mL-1)刺激后，再分別加入DEX 10-12，10-10，10-8和10-6mol·L-1，PBMC分泌的IL-2分別為371±447 pg·mL-1(n=11)、287±313 pg·mL-1(n=14)、293±338 pg·mL-1(n=17)和144±157 pg·mL-1(n=17)。

圖1 DEX對(duì)PHA誘導(dǎo)PBMC產(chǎn)生IL-2的抑制作用

2.2 IL-2和IL-4刺激誘導(dǎo)DEX抵抗的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建 見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，加入IL-2和IL-4顯著地降低了DEX對(duì)PHA誘導(dǎo)的IL-2生成的抑制能力(n=11)。未加入和聯(lián)合加入IL-2和IL-4對(duì)比，低劑量的DEX 10-10mol·L-1，抑制率為52%對(duì)比0%；劑量為DEX 10-10mol·L-1時(shí)，抑制率為66%對(duì)比26%；較高劑量的DEX 10-6mol·L-1，抑制率為87%對(duì)比21%，對(duì)比顯著。說(shuō)明IL2和IL-4顯著降低了志愿者對(duì)于DEX敏感性，也即誘導(dǎo)DEX發(fā)生了抵抗性，IL-2(13 ng·mL-1)和IL-4(6.5ng·mL-1)共同刺激PBMC可以作為誘導(dǎo)DEX抵抗的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。由圖2可知，加入IL-2和IL-4刺激，DEX對(duì)PHA誘導(dǎo)的PBMC生成的IL-2的抑制率(%)顯著降低。

圖2 IL-2和IL-4誘導(dǎo)的DEX抵抗

2.3 17HPC逆轉(zhuǎn)DEX抵抗 利用IL-2和IL-4刺激誘導(dǎo)DEX抵抗的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，即不同濃度DEX單獨(dú)或者與17HPC聯(lián)合，PHA刺激24 h后檢測(cè)PBMC上清中的IL-2的產(chǎn)生。以陰性對(duì)照(細(xì)胞+PHA，IL-2和IL-4刺激，但不加17HPC和DEX) 對(duì)單個(gè)核細(xì)胞分泌IL-2的抑制率為0%來(lái)計(jì)算，單用DEX(0, 10-12, 10-10, 10-8和10-6mol·L-1)對(duì)IL-2的抑制率分別為0%, 49%, 57%, 46%和78%；17HPC 10-11mol·L-1與以上濃度DEX聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，抑制率分別為39%, 63%, 78%, 77%和99%；17HPC 10-10mol·L-1與以上濃度DEX聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，抑制率分別為43%, 82%, 76%, 76%和96%；17HPC 10-7mol·L-1與以上濃度DEX聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，抑制率分別為37%, 85%, 86%, 69%和99%；17HPC 10-5mol·L-1與以上濃度DEX聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，抑制率分別為69%, 76%, 81%, 81%和97%。由此可知，較高劑量的10-6mol·L-1的DEX抑制IL-2釋放的抑制率為78%，而低劑量DEX(10-10mol·L-1或者10-12mol·L-1，加入17HPC(10-11mol·L-1或者10-10mol·L-1)，將獲得大約相同的抑制率(與DEX相比，IL-2抑制率約為78%)。即僅僅使用萬(wàn)分之一或者十萬(wàn)分之一的劑量，就可獲得類似的抗炎效應(yīng)。

在17HPC的濃度為0, 10-11, 10-10, 10-7和10-5mol·L-1時(shí)，通過(guò)以上抑制率計(jì)算DEX的IC50，分別為7.06×10-11, 6.13×10-13, 2.26×10-13, 1.81×10-13和3.22×10-13mol·L-1?？芍尤?7HPC后，可以至少降低DEX的IC50的值100倍以上。

3 討論

糖皮質(zhì)激素對(duì)人PBMC在IL-2和IL-4誘導(dǎo)下敏感性降低的研究模型，可用于評(píng)價(jià)和篩選糖皮質(zhì)激素抵抗性和敏感性的可能調(diào)節(jié)劑[3-6]。PBMC是終末分化細(xì)胞，是糖皮質(zhì)激素作用的主要靶細(xì)胞之一，它對(duì)激素的反應(yīng)性低下與臨床腎病綜合征、支氣管哮喘、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等激素抵抗現(xiàn)象相關(guān)[7]。PHA是植物血凝素類多克隆刺激劑，通過(guò)細(xì)胞表面的CD3-TCR復(fù)合體作用于人的T細(xì)胞刺激其增殖。IL-2又名T細(xì)胞生長(zhǎng)因子(T cell growth factor，TCGF)，主要由活化的T細(xì)胞合成分泌，是參與炎癥反應(yīng)的重要因子。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)IL-2、IL-4和PHA分別刺激PBMC分泌IL-2，建立誘導(dǎo)PBMCs 產(chǎn)生糖皮質(zhì)激素抵抗的模型，進(jìn)行藥物逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素抵抗的實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-2和IL-4作用于外周血單個(gè)核細(xì)胞，可明顯降低地塞米松對(duì)其抑制作用的反應(yīng)性，可作為評(píng)價(jià)糖皮質(zhì)激素耐受性的細(xì)胞研究模型。在健康男性中，加入17HPC，僅僅使用萬(wàn)分之一或者十萬(wàn)分之一的最初DEX的劑量，就可獲得類似的抗炎效應(yīng)；降低DEX的IC50至少100倍以上。因此，17HPC可改善DEX使用的安全性，減輕不良反應(yīng)的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)直接采用人外周血進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具有一定的臨床意義；采用單個(gè)核細(xì)胞建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停勺鳛樘瞧べ|(zhì)激素增敏劑的篩選平臺(tái)，具有方便、靈敏、快捷的特點(diǎn)。不足之處是所選樣本量少，需加大樣本量繼續(xù)研究。

實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)，孕激素17α-己酸羥孕酮具有逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素抵抗性和提高糖皮質(zhì)激素敏感性的作用，為糖皮質(zhì)激素抵抗患者提供了新的思路和藥物治療手段。

參考文獻(xiàn):

[1] 孫云, 陳亞紅. 氣道慢性炎癥疾病激素抵抗機(jī)制的研究進(jìn)展[J].國(guó)際呼吸雜志, 2011, 31(13):1021-1024.

[2] 王雪萍, 姜儻. 糖皮質(zhì)激素受體與糖皮質(zhì)激素抵抗[J]. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 33(8)：940-941.

[3] Creed T J, Lee R W, Newcomb P V, et al. The effects of cytokines on suppression of lymphocyte proliferation by dexamethasone [J]. J Immunol, 2009, 183(1)：164-171.

[4] KamJ C, Szefler S J, Surs W, et al. Combination IL-2 and IL-4 reduces glucocorticoid receptor-binding affinity and T cell response to glucocorticoids [J]. J Immunol, 1993, 151(7):3460-3466.

[5] Bessler H, Straussberg R, Gurary N, et al. Effect of dexamethasone on IL-2 and IL-3 production by mononuclear cells in neonates and adults[J]. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed, 1996, 75(3) :F197-201

[6] Irusen E, Matthews J G, Takahashi A, et al. p38 Mitogen-activated protein kinase-induced glucocorticoid receptor phosphorylation reduces its activity：role in steroid-insensitive asthma [J]. J Allergy Clin Immunol, 2002, 109(4) :649-657.

[7] Hirano T, Akashi T, Keira T, et al. Clinical impact of cyclosporine cellular pharmacodynamics in minimal change nephrotic syndrome [J]. Clin Pharmacol Ther, 2000, 68(5):532-540.