費(fèi) 元,鐘 丹 ,韓 雪 ,龐基良

(1.杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 浙江 杭州 310036；2.浙江省紹興市魯迅中學(xué)分校, 浙江 紹興 312000)

赤霉素(GA)是一種重要的植物激素，它調(diào)節(jié)許多植物的生長和發(fā)育過程，如種子萌發(fā)、葉的生長、根莖的伸長、花的發(fā)育以及果實(shí)的膨大等[1].赤霉素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)由正向作用因子和反向作用因子調(diào)節(jié)，GAI基因是GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的反向作用因子之一，它編碼的蛋白屬于GRAS家族的DELLA蛋白，DELLA蛋白在GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮著重要作用，赤霉素通過泛素化降解途徑促使DELLA蛋白降解，從而引起赤霉素反應(yīng)基因的表達(dá)[2].目前已從擬南芥(Arabidopsisthaliana)、豌豆(Pisumsativum)、楊樹(Populusalba)蘋果(Maluspumila)、葡萄(Vitisvinifera)[3-7]等多個物種中克隆到GAI的同源基因.GAI的功能缺失會產(chǎn)生擬南芥突變體ga1-3 遲開花的表型，說明GAI起抑制花轉(zhuǎn)變的作用[8].擬南芥的GAI基因在水稻中過表達(dá)會引起植株的矮化，而這可能會產(chǎn)生一系列的水稻高產(chǎn)品種[9].葡萄的VvGAI突變會引起在原本形成卷須的部位產(chǎn)生花序[10].VvGAI還與葡萄的育性、串重、果實(shí)品質(zhì)相關(guān)[11].以上研究表明GAI基因與株高、花芽分化以及果實(shí)發(fā)育密切相關(guān).

我們通過在培養(yǎng)基中添加赤霉素和細(xì)胞分裂素，建立了離體培養(yǎng)大巖桐花被切塊高頻率直接再生花芽的實(shí)驗(yàn)體系[12-13].GAI基因既是GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的反向作用因子，又在花發(fā)育中起作用，本研究克隆了大巖桐的GAI同源基因，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，初步研究了大巖桐GAI同源基因的功能.

1 材料與方法

1.1 供試材料

本實(shí)驗(yàn)所用的大巖桐(Sinningiaspeciosa)，種植于杭州師范大學(xué)玻璃溫室.取新鮮花蕾分裝，于液氮中保存?zhèn)溆?

1.2 方 法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA合成

采用異硫氰酸胍法(GT)提取花蕾(直徑約5 mm)組織的總RNA，取2 μg RNA，使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(ToYoBo，Code：FSK-100)合成cDNA.

1.2.2 GAI基因保守區(qū)克隆

通過對已經(jīng)在GenBank上發(fā)布的擬南芥等植物GAI同源基因序列的比對，在其保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對引物，Della 004：5’-CAC GCC ACC ACG TTGCAG AT-3’ ，Della 005：5’ -GCACTT CTA CGA GAC CTG CC -3’ ，以反轉(zhuǎn)錄后的大巖桐cDNA為模板進(jìn)行PCR，PCR的條件是94 ℃ 3 min，94 ℃45 s，55 ℃45 s，72 ℃1.5 min，72 ℃10 min ，30個循環(huán).將該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖電泳后，利用DNA 膠回收試劑盒回收，連接到pMD18-T 測序載體，送上海生工公司測序.

1.2.3 3’端的克隆

根據(jù)測序得到的GAI保守區(qū)序列，在序列內(nèi)部設(shè)計(jì)兩個5’端巢式引物與試劑盒所帶引物形成嵌套，以第一鏈cDNA為模版進(jìn)行3’RACE.兩個5’端的引物Della 007(Outer): 5’ -TTT GGT ATG AAA CAG GGA ATG C -3’；Della 008(Inner): 5’- CAA GCA TTG GCG TTG AGG C -3’.試劑盒所帶引物：3RACE(Outer)：5’ - TAC CGT CGT TCC ACT AGT GAT TT -3’；3RACE(Inner)：5’- CGC GGA TCC TCC ACT AGT GAT TTC ACT ATA GG -3’.

1.2.4 5’端的克隆

根據(jù)已知的中間序列，設(shè)計(jì)兩個3’端巢式引物與試劑盒所帶引物形成嵌套.以第一鏈cDNA 為模板按照試劑盒方法進(jìn)行5’RACE，將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物回收后，連接到pMD18-T測序載體后，送上海生工公司測序.兩個3’端巢式引物是Della 012(Outer)：5’ -TCC AAT GAA ACG AAA AGG GTC -3’；Della 010(Inner)：5’ -CCA CCG TCT CAC CTT CCC TAA -3’.試劑盒所帶引物5RACE(Outer)：5’ -CAT GGC TAC ATG CTG ACA GCC TA -3’；5RACE(Inner)：5’ -CGC GGA TCC ACA GCC TAC TGA TGA TCA GTC GAT G -3’.

1.2.5 GAI基因全長的克隆

用DNAstar 軟件拼接所得的3 段序列(中間序列、3’端序列和5’端序列)，根據(jù)拼接結(jié)果，在兩端設(shè)計(jì)基因的特異性引物，全長引物是SsGAI001：5’ -CGG GAT CCT TTC AAG AAA ATG AAG AGA GAC CAC -3’; SsGAI002：5’ -CGA GCT CCA AAC CAG ACC GGG TTT CAC TC-3’，進(jìn)行全長PCR 擴(kuò)增，將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物回收后，連接到pMD18-T 測序載體后，送上海生工公司測序.

1.2.6 生物信息學(xué)分析

將測序結(jié)果通過NCBI 網(wǎng)站進(jìn)行核苷酸序列比對(Blastn)和氨基酸序列比對(Blastp)；用DNAman 4.0 進(jìn)行氨基酸序列比對分析；根據(jù)同源比對結(jié)果，用MEGA 4.1 進(jìn)行進(jìn)化樹分析.

1.2.7 SsGAI器官特異性表達(dá)分析

由圖6可知，當(dāng)傳輸距離為1 km時，隨著能見度的增加，三種輻射波在平流霧和輻射霧中的透過率均逐漸增加，且在相同的輻射波和能見度下，平流霧的衰減均大于輻射霧的衰減.相同能見度下三種輻射波衰減程度由小到大排序，在平流霧中依次是10.6 μm、1.064 μm和3.8 μm，在輻射霧中依次是10.6 μm、3.8 μm和1.064 μm.

分別提取大巖桐的根、莖、葉、花萼和直徑5mm花芽的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到不同組織的cDNA，以肌動蛋白(Actin)作為內(nèi)標(biāo)對cDNA模板進(jìn)行半定量，通過對不同的cDNA模板進(jìn)行RT-PCR，確定SsGAI在不同組織中的表達(dá)量.PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸60 s，擴(kuò)增30 個循環(huán)；72℃延伸10 min.Actin 的引物為ActinF：5’-GGAGAAGATCTGGCATCACA-3’，ActinR：5’-CCTCCAATAAAGACACTGTA-3’.

1.2.8 SsGAI的載體構(gòu)建和煙草轉(zhuǎn)化

以pBI121為基礎(chǔ)，CaMV 35S為啟動子，構(gòu)建SsGAI同源基因全長ORF序列的超表達(dá)載體.用BamHI和SacI對克隆載體pMD18-T Simple進(jìn)行雙酶切，所得ORF連接到用相同內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切的pBI121載體上，取代GUS基因，獲得pBI121-SsGAI表達(dá)載體.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue.構(gòu)建過程中質(zhì)粒DNA 小量提取、酶切、片段回收均參照試劑盒(上海生工公司產(chǎn)品)說明書進(jìn)行.

使用凍融法(參考分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第2版)將pBIN19-35S-SsGAI表達(dá)載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌GV3101 中，用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草(品種為“黃苗魚”)，在含80 μg · mL-1卡那霉素的MS 培養(yǎng)基上篩選幼苗，轉(zhuǎn)基因陽性苗經(jīng)過煉苗后，移栽至花盆中，栽培基質(zhì)為泥炭∶珍珠巖=3∶1，培養(yǎng)在人工氣候室，24 ℃，12 h/18 ℃，12 h.

轉(zhuǎn)基因煙草苗(T0 代)移栽30 d 后，對9株轉(zhuǎn)基因煙草的葉片進(jìn)行了SsGAI的RT-PCR 分析.并于轉(zhuǎn)基因煙草苗移栽75 d 后，仔細(xì)觀察各種花器官的形態(tài)變化.

2 結(jié)果與分析

2.1 SsGAI 基因的序列

根據(jù)GAI保守序列設(shè)計(jì)引物，以大巖桐花蕾cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得一條608bp的特異片段，用RACE法分別獲得3’端1150bp和5’端1256bp的目的片段.將已得到的三段序列通過DNAman軟件進(jìn)行拼接，根據(jù)拼接序列在ORF兩端設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得SsGAI的全長ORF序列，長度為1689 bp.

2.2 SsGAI 全長序列生物信息學(xué)分析

通過序列拼接得到SsGAI的全長序列.SsGAI的cDNA全長為2147 bp，該序列包含一個完整的開放閱讀框(ORF)，長度為1689 bp，編碼562個氨基酸，起始密碼子為ATG，在序列的5’端17-18核苷酸處可能有一段信號肽剪切位點(diǎn)，含有加尾信號AATAA1-3序列和poly(A)11序列(圖1).該序列的GenBank登錄號為FJ594773.Blastp分析發(fā)現(xiàn)，SsGAI與葡萄的VvGAI及陸地棉的GhGAI相似性分別為68%、64%.

圖1 大巖桐SsGAI基因全長序列和推測的氨基酸序列

2.3 SsGAI 氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

在軟件MEGA 4.1平臺上構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，對SsGAI基因編碼的氨基酸與GenBank記載的13種GAI蛋白之間構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行聚類分析.圖3結(jié)果顯示：SsGAI與葡萄的VvGAI及陸地棉的GhGAI相似性分別為68%、64%.大巖桐SsGAI歸屬于GRAS家族中的雙子葉家族的分類群，而與單子葉植物親緣關(guān)系較遠(yuǎn).

2.4 SsGAI基因的器官特異性表達(dá)分析

如圖4所示，以大巖桐Actin為內(nèi)參，SsGAI在葉、花萼、直徑5 mm的花芽、根中都有表達(dá)，且在花萼中表達(dá)量較高，但是在莖中表達(dá)沉默.

圖2 大巖桐及其他植物GAI氨基酸序列同源性比對

注：系統(tǒng)發(fā)育樹分析及多序列比對所涉及到的有關(guān)基因序列如下：大巖桐的SsGAI(ACM47244.1)；杜梨的pbGAI(AFJ23219.1); 蘋果的mdGAI(ADW85805.1)；玫瑰的RoGAI(AGK07287.1);陸地棉的GhGAI(ACR58455.1)；毛白楊的PtGAI(AFP58844.1)； 海島棉的GbGAI(ABG26370.1)；胡桃的JrGAI(AEE69074.2)；萵苣的LsGAI(BAG71200.1)；蓖麻的RcGAI(XP_002527794.1)； 獼猴桃的AdGAI(AHB17742.1)；可可的TcGAI(XP_007045197.1)；葡萄的VvGAI(AEK06229.1)

2.5 轉(zhuǎn)SsGAI煙草的表型分析

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將SsGAI基因轉(zhuǎn)化煙草，在轉(zhuǎn)基因苗移栽30 d后，對轉(zhuǎn)基因煙草葉片進(jìn)行了SsGAI表達(dá)的RT-PCR檢測分析.結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)基因煙草中檢測到了SsGAI的表達(dá)，野生型中未檢測到SsGAI的表達(dá)(見圖5)，說明SsGAI已整合進(jìn)煙草基因組，并成功表達(dá).

注：L：葉；S：花萼；F：直徑5mm花芽；R：根；ST：莖

注： M: MarkerⅢ; 1-9：轉(zhuǎn)化植物；10:野生型植株

轉(zhuǎn)基因煙草移栽75d后開始觀察并記錄其表型變化，野生型煙草的花有5個花瓣，轉(zhuǎn)SsGAI煙草的花表現(xiàn)出了兩種新的表型：1)6瓣花，出現(xiàn)頻率為18.06%；2) 8瓣花，出現(xiàn)頻率為30.56%(表1).且轉(zhuǎn)基因煙草的植株高度顯著下降，花期延遲(見圖6).

表1 移栽后轉(zhuǎn)基因煙草的花型及株形變化

A.轉(zhuǎn)化SsGAI和野生型的煙草植株，a為轉(zhuǎn)化SsGAI的植株；b為野生型植株；B．野生型的開放花，花瓣5枚；C. 轉(zhuǎn)SsGAI 的開放花，花瓣6枚；D. 轉(zhuǎn)SsGAI 的開放花，花瓣8枚.

3 結(jié) 語

DELLA蛋白作為GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要反向作用因子，起著調(diào)節(jié)植物生長和發(fā)育過程的作用. 本研究克隆了大巖桐SsGAI基因，并利用生物信息學(xué)對SsGAI進(jìn)行了系統(tǒng)分析.SsGAI基因推導(dǎo)的蛋白序列與其他植物有一定差異，但均含有保守的DELLA結(jié)構(gòu)域，且N端都含有酶活性中心區(qū)域TVHYNP，表明在進(jìn)化中基因功能結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性.大巖桐SsGAI編碼的多肽鏈無信號肽酶切位點(diǎn)，表明SsGAI在細(xì)胞中合成后，不進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)，其在細(xì)胞內(nèi)的準(zhǔn)確定位還有待研究.

SsGAI在根、葉、花萼、花芽中都有表達(dá)，但是在莖中表達(dá)沉默，推測該基因可能在各個器官中發(fā)揮著不同的調(diào)節(jié)作用.

SsGAI轉(zhuǎn)化煙草植株株型矮化，花瓣數(shù)量增加，這表現(xiàn)為GA缺失的表型,這可能是DELLA蛋白的過量表達(dá)使其抑制功能進(jìn)一步加強(qiáng)，抑制了赤霉素的作用，使植株矮化、節(jié)間變短和花發(fā)育發(fā)生異常等.Hani等[14]將一個擬南芥GAI基因轉(zhuǎn)化煙草，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株也表現(xiàn)花瓣數(shù)增加，此外還有雄蕊花瓣化現(xiàn)象發(fā)生.Llewelyn等[15]將35S：GAI轉(zhuǎn)入煙草，轉(zhuǎn)基因植株矮化，花和果莢發(fā)育異常.在番茄中過量表達(dá)蘋果Mhgai1，會表現(xiàn)出花器官變小和單性結(jié)實(shí)的性狀[16].

綜上所述，本研究克隆得到了大巖桐SsGAI基因的全長cDNA，并對該基因序列，其編碼的氨基酸序列、功能結(jié)構(gòu)域及在器官中的表達(dá)區(qū)域等進(jìn)行了初步分析，并將其置于煙草中異位表達(dá)，進(jìn)一步研究了它對植物生長發(fā)育的影響.

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