饒桂波，邵洪澤，胡桂學(xué)，吳健敏*

(1.廣西獸醫(yī)研究所，廣西 南寧 530001；2.吉林省獸醫(yī)科學(xué)研究所，吉林 長春 130062；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130118)

一株GPV的分離鑒定及致病性研究

饒桂波1，邵洪澤2，胡桂學(xué)3*，吳健敏1*

(1.廣西獸醫(yī)研究所，廣西 南寧 530001；2.吉林省獸醫(yī)科學(xué)研究所，吉林 長春 130062；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130118)

為了確定導(dǎo)致吉林省某地區(qū)10日齡雛鵝發(fā)病的病原，從病死雛鵝的肝臟中分離到一株病毒，根據(jù)病毒的電鏡照片，動物回歸試驗及PCR鑒定，確定為鵝細小病毒。PCR產(chǎn)物測序后經(jīng)BLAST比對顯示，分離毒株與NCBI收錄的GPV VP3基因同源性均在92%以上，與GPV/CH/HLJ02/08 VP3基因的同源性最高，達99%。致病性研究表明，分離株的ELD50為10-6.5/0.2 mL，毒力較強，且該毒株能被GPV標準血清所中和。

鵝細小病毒；分離鑒定；致病性

小鵝瘟是由鵝細小病毒(Goose parvirus，GPV)引起的雛鵝的一種急性或亞急性的敗血性傳染病，病毒主要侵染鵝的腸部，患病鵝主要表現(xiàn)為出血性、纖維素性和滲出性腸炎，發(fā)病后期能形成腸內(nèi)栓塞。該病毒主要侵害3周內(nèi)的雛鵝和雛番鴨，具有傳播快、死亡率高的特點，發(fā)病耐過的雛鵝和番鴨表現(xiàn)為生長發(fā)育遲緩[1]。1956年我國學(xué)者方定一首先發(fā)現(xiàn)了該病，十多年后許多歐洲國家發(fā)現(xiàn)該病并報道稱為Derzsy's病，后確定該病的病原體為鵝細小病毒。自此以后許多國家都報道了鵝細小病毒病的發(fā)生和流行[2-3]。

2011年5月吉林省某養(yǎng)鵝場10日齡吉林白鵝大批死亡。詢問得知雛鵝和種鵝均未接種過小鵝瘟疫苗或抗小鵝瘟血清。病鵝死前腹瀉嚴重，糞便呈綠色，瀕死期角弓反張。剖檢見小腸內(nèi)有栓子，切面輪層狀。采集病料后經(jīng)實驗室診斷為鵝細小病毒病。

1 材料與方法

1.1 病料采集

無菌采集吉林省某地區(qū)送檢的病死鵝肝臟。

1.2 試驗鵝胚及雛鵝

無GPV母源抗體的鵝胚和10日齡雛鵝，購自吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院。

1.3 培養(yǎng)基的制備

按常規(guī)方法制普通瓊脂平板、馬丁瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板。

1.4 主要試劑

高免血清和GPV JLDA株由吉林省獸醫(yī)科學(xué)研究所贈送；Taq DNA Polymerase、dNTPs、100 bp DNA Ladder等，購自寶生物公司。

1.5 PCR引物

根據(jù)GenBank上鵝細小病毒VP3基因設(shè)計合成引物，P1：5'-ATAAGCGCC TTTCACAGC-3'；P2：5'-AAC GCA GGA TCA GAC GAA-3'

1.6 細菌的分離培養(yǎng)

取病死鵝的肝組織分別無菌接種LB普通瓊脂平板、馬丁瓊脂平板、巧克力瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細菌生長情況。

1.7 病毒的分離培養(yǎng)

采集病死鵝肝臟，經(jīng)常規(guī)處理后，經(jīng)尿囊腔接種發(fā)育良好的12日齡鵝胚，0.2 mL/枚，10枚/組。對照組接種無菌生理鹽水。37 ℃培養(yǎng)，每隔8h觀察鵝胚生長情況。去除24 h內(nèi)死亡的鵝胚，無菌收集24 ～120 h之間死亡鵝胚尿囊液，冷凍保存?zhèn)溆?，并連續(xù)傳5代。

1.8 雛鵝回歸試驗

檢測無母源抗體的1日齡雛鵝，隨機分為2組，10只/組。第1組肌肉接種分離毒株尿囊液；第2組接種生理鹽水作對照組，0.2 mL/只。兩組雛鵝均分別隔離飼養(yǎng)觀察。

1.9 分離毒株電鏡觀察

取出現(xiàn)病變的鵝胚尿囊液，1 000 r/min 離心10 min，上清液置于銅網(wǎng)上，2%磷鎢酸負染1～2 min，于JME2100EA Ⅲ(日本)透射電鏡觀察并照相。

1.10 PCR檢測

以提取的分離毒和標準毒的核酸為模板，采用50 μL反應(yīng)體系：在0.5 mL反應(yīng)管中依次加10×Buffer 5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、滅菌雙蒸水35 μL、2 U/μL Taq酶1 μL、20 pmol/μL上游引物、下游引物各1 μL、模板5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 40 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。擴增片段經(jīng)瓊脂糖凝膠鑒定后，送寶生物公司測序。

1.11 分離株ELD50 的測定

收獲的穩(wěn)定毒株作10倍梯度稀釋后，經(jīng)尿囊腔分別接種12日齡鵝胚，每個稀釋度接種10枚，0.2 mL/枚，共10組。同時設(shè)無菌生理鹽水對照組。接種后繼續(xù)孵化，棄24 h內(nèi)死亡的鵝胚。統(tǒng)計24 ～120 h內(nèi)鵝胚死亡情況，按Reed-Muench法計算ELD50，并剖檢死亡鵝胚觀察病變情況。

1.12 雛鵝保護試驗

取1日齡雛鵝40只，隨機分為4組。第1組肌肉注射特異性高免血清，1 mL/只，24 h后用分離株尿囊液經(jīng)肌肉注射攻毒，0.2 mL/只；第2組不注射特異性高免血清，24 h后同樣用分離株尿囊液經(jīng)肌肉注射攻毒，0.2 mL/只；第3組肌肉注射特異性高免血清，0.2 mL/只；第4組無菌生理鹽水作對照組，0.2 mL/只。4組試驗雛鵝均隔離飼養(yǎng)觀察。

1.13 鵝胚中和試驗

取12日齡鵝胚40枚，隨機分為4組。第1組將收獲的標準株尿囊液作1∶10稀釋，與高免血清等體積混合后，37 ℃感作1 h；第2組將分離株傳代尿囊液作1∶10稀釋，與高免血清混合液37 ℃感作1 h；第3組為高免血清；第4組為無菌生理鹽水對照組。各組鵝胚均經(jīng)尿囊腔接種，0.2 mL/枚，接種后繼續(xù)孵化，觀察鵝胚死亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 細菌分離培養(yǎng)結(jié)果

無菌取剖檢的病死鵝肝臟，分別劃線接種于制備好的各種培養(yǎng)上，進行細菌分離培養(yǎng)，結(jié)果均無細菌生長。

2.2 病毒分離培養(yǎng)結(jié)果

處理的病料取上清，無菌接種于鵝胚尿囊腔，0.2 mL/枚，結(jié)果表明，試驗組鵝胚孵化至48～120 h全部死亡，對照組均未死亡，于120 h后4 ℃處死，試驗結(jié)果如表1所示。

表1 病料接種鵝胚的試驗結(jié)果Table 1 The experimental result of disease inoculation in goose embryos

表2 死亡鵝胚尿囊液經(jīng)鵝胚接種盲傳的結(jié)果Table 2 The result of death embryo allantoic fluid inoculated in goose by blind passage

取48～112 h死亡鵝胚的尿囊液，100倍稀釋后，分別接種鵝胚，盲傳5代。結(jié)果如表2所示，盲傳至第3代后，鵝胚多于72～96 h內(nèi)死亡。剖檢112 h內(nèi)死亡的鵝胚，見胚體、絨毛尿囊膜水腫，翼和爪末端有明顯的出血點，胚頭、眼兩側(cè)充血嚴重，喙部有點狀出血。

2.3 雛鵝回歸試驗結(jié)果

試驗組經(jīng)肌肉接種分離毒株尿囊液，雛鵝的感染及死亡情況如表3所示，接種48 h后全部發(fā)病，240 h后9只死亡。患鵝表現(xiàn)為食欲不振，行動遲緩，呆立不穩(wěn)，喜臥，排出灰白色或黃綠色稀糞并混有氣泡。剖檢3～4日齡病死鵝，全身呈敗血變化，肝、腎腫大，胰腺腫大呈淡黃色，泄殖腔擴張。4～10日齡死亡雛鵝的小腸粘膜脫落，凝固，剖開回盲部見有灰白色栓子，質(zhì)地堅硬。膽囊膨大充滿膽汁，肝臟呈黃色，心冠狀脂肪有針尖大小點狀出血。對照組雛鵝健康，未出現(xiàn)臨床癥狀。

表3 雛鵝攻毒回歸試驗結(jié)果Table 3 The result of regression test for Goslings attacked by virus

2.4 電鏡觀察結(jié)果

死亡鵝胚尿囊液進行磷鎢酸負染后，電鏡觀察， 可見病毒粒子直徑約20 nm，無囊膜，具有細小病毒的特征，如圖1所示。

圖1 電鏡觀察結(jié)果Fig.1 The result of the electronmicroscopy

2.5 PCR鑒定結(jié)果

PCR擴增產(chǎn)物電泳后，在紫外燈下觀察到1條約430 bp的特異性條帶，與預(yù)期的目的片段大小相符(圖2)。

圖2 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果1.DL2000 DNA Marker；2.病料；3.病毒尿囊液；4.陰性對照；5.陽性對照Fig.2 The results of electrophoresis of PCR products 1.DL2000 DNA Marker; 2.Diseased;3.Virus allantoic fluid;4.Negative control;5.Positive control

2.6 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果分析

將PCR擴增片段的序列在GenBank中進行BLAST比對，與GPV VP3基因同源性均在92%以上。其中與2008年黑龍江分離的GPV/CH/HLJ02/08 VP3基因同源性最高達99%，與2004年法國分離的GPV D146/02 VP3基因同源性最低但是也能達到達92%。表明本試驗分離毒株為鵝細小病毒，命名為GPV/CH/JLTP/05/11株。對近年來GenBank上錄入的所有GPV基因序列進行比對，制作遺傳進化樹結(jié)果如圖3所示。

遺傳進化樹分析顯示目前流行的GPV毒株有兩個關(guān)系較近的基因群，本研究分離毒株與GPV/CH/ HLJ02/08 VP3所在群關(guān)系較近。GPV/CH/JLTP/05/11株基因片段與黑龍江和吉林的地方株VP3序列比對發(fā)現(xiàn)，與GPV/CH/HLJ02/08(99%)關(guān)系較近，而與吉林省地方分離株型JLDA株(96%)的關(guān)系反而較遠。對三個序列比較后，用DAMBE軟件分析位點變化率，結(jié)果見圖4，集中于351 nt處，為變異的高頻位點。

2.7 分離株ELD50測定

取分離毒株尿囊液10倍梯度稀釋后，接種于12日齡鵝胚，統(tǒng)計24 h～120 h內(nèi)死亡情況，如表4所示，經(jīng)Reed-Muench法計算ELD50，分離株的ELD50為10-6.5/0.2 mL。

2.8 雛鵝保護試驗結(jié)果

雛鵝注射高免血清后，經(jīng)肌肉接種分離株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第1組攻毒后觀察10 d全部存活，且無明顯臨床癥狀。不注射特異性高免血清第2組攻毒后觀察10 d全部死亡，死前有腸炎癥狀，死后解剖有小鵝瘟特征性病變，如圖5所示；僅注射特異性高免血清的第3組及注射無菌生理鹽水的4組觀察10 d全部存活，且無明顯臨床癥狀。

2.9 鵝胚中和試驗結(jié)果

分離株尿囊液10倍稀釋，與高免血清混合液感作后經(jīng)尿囊腔接種12日齡鵝胚，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組鵝胚120 h全部存活，鵝胚無病變。

圖3 JLTPVP3基因進化樹分析結(jié)果Fig.3 The results of JLTP strain VP3 gen Phylogenetic analysis

表4 JLTP分離毒株ELD50測定結(jié)果Table 4 The determination results of ELD50 isolated from JLTP

圖4 位點變異率Fig.4 Substitution rates over sites

圖5 病死雛鵝形成腸內(nèi)栓塞物Fig.5 Intestinal embolus for dead goslings

3 討 論

本試驗經(jīng)病毒分離、電鏡負染尿囊液觀察、動物回歸試驗、PCR檢測、中和試驗結(jié)果表明，所分離的病毒為GPV，由此確診吉林某地發(fā)生的疫情為小鵝瘟。通過對所得的目的基因的Blast比較、遺傳進化樹分析結(jié)果表明：分離到的GPV與2008年分離的黑龍江度GPV/CH/HL J02/08 VP3基因同源性最高，達99%。而與吉林省獸醫(yī)科學(xué)研究所2004年分離的地方株型JLDA株同源性相對較差，96%。產(chǎn)生這一差異這可能是由于近年吉林省養(yǎng)鵝效益好，導(dǎo)致養(yǎng)殖數(shù)量激增，從黑龍江省引種帶入該毒株。因此提醒廣大養(yǎng)鵝業(yè)戶，應(yīng)及時接種小鵝瘟疫苗或高免血清，防止本病流行的同時，注意引進雛鵝的檢疫，以及科學(xué)化的飼養(yǎng)管理。

研究分離株的致病性，其ELD50為10-6.5/0.2 mL，毒力較強。分毒鵝胚尿囊液經(jīng)盲傳后，僅到第三代毒力已趨穩(wěn)，這表明該毒株在吉林某地區(qū)應(yīng)該存在一段時間了，且毒力有增強趨勢。GPV僅有一個血清型[4]，經(jīng)鵝胚中和試驗和雛鵝保護性試驗發(fā)現(xiàn)，該毒株能被標準株高免血清中和，表明其血清型沒有改變，但病毒基因分析有兩個相近群，未來依然要加強病毒血清型的監(jiān)測。

根據(jù)流行病學(xué)，結(jié)合臨診癥狀和特有的病理變化可對小鵝瘟進行初診斷，確診需進行病毒分離，病毒中和試驗、瓊脂擴散試驗和ELISA試驗[5-7]檢查血清中特異性抗體，從而判斷未免疫鵝群感染過或正感染鵝細小病毒，而PCR檢測技術(shù)更具有敏感性和特異性的特點，能夠準確檢測病原[8-10]。GPV的防控主要從管理、預(yù)防和治療三個方面著手。目前的防治小鵝瘟的有效方法，一是接種疫苗，二是采用高免卵黃液或血清進行緊急預(yù)防和治療。種鵝接種GPV疫苗后能產(chǎn)生中和抗體，并經(jīng)卵黃傳給雛鵝，使其獲得天然被動免疫，從而抵抗GPV的侵襲。需要注意的是種鵝免疫GPV疫苗后，產(chǎn)生的母源抗體將會影響雛鵝活疫苗的免疫效果，應(yīng)進行母源抗體檢測，選擇合適的時間進行GPV疫苗免疫。

[1]方定一,王永坤,鄭玉美,等.小鵝瘟病原體及其特異性防治的研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),1981(1)：1-8.

[2]Kozdruń W,Wozniakowski G,Samorek-Salamonowicz E,et al.Viral infection in goose flocks in Poland[J].Polish Journal of Veterinary Sciences,2012,15(3):525-30.

[3]Irvine R,Ceeraz V,Cox B,et al.Goose parvovirus in Great Britain[J].Veterinary Record,2008,163(15): 461.

[4]Shien J H,Wang Y S,Chen C H,et al.Identification of sequence changes in live attenuated goose parvovirus vaccine strains developed in Asia and Europe[J].Avian Pathology,2008,37(5): 499-505.

[5]Fan J H,Zuo Y Z,Yang Z,et al.The development of an indirect ELISA for the detection of antibodies to goose parvovirus in blood serum [J].Letters in applied microbiology,2013,57(1):26-32.

[6]Yang J L,Cheng A C,Wang M S,et al.Development of a fluorescent quantitative real-time polymerase chain reaction assay for the detection of Goose parvovirus in vivo[J].Virology Journal,2009(6): 142.

[7]劉 菲,唐衛(wèi)杰,程安春,等.抗鵝細小病毒卵黃IgG的制備及其間接ELISA檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2011,41(06):601-606.

[8]布日額，王君偉，吳金花，等.GPV 野毒株的分離及 PCR 檢測方法的應(yīng)用[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2003，25(6): 469-472.

[9]Chen Z,Li C,Liu G,et al.Rapid diagnosis of goose viral infections by multiplex PCR [J].Journal of Virological Methods,2013,191(2):101-104.

[10]劉家森,姜 騫,司昌德,等.番鴨細小病毒與鵝細小病毒 PCR 鑒別診斷方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué),2007,37 (6): 469-472.

Isolation，IdentificationandPathogenicityofaStrainofGPV

RAO Gui-bo1,SHAO Hong-ze2,HU Gui-xue3*,WU Jian-min1*

(1.GuangxiVeterinaryResearchInstitute,NanningGuangxi,530001,China;2.JilinInstituteofVeterinaryScience,ChangchunJilin,130062,China; 3.JilinAgriculturalUniversity,ChangchunJilin,130118,China)

A strain of Goose parvirus isolated from the livers of dead goslings in an area of Jilin province was identified to be the pathogen of the 10-day-old goslings disease based on its electron micrograph,animal regression test and PCR results.A comparison through BLAST showed that the VP3 gene of the isolated strain had a homology of more than 92% with those of the GPV included in NCBI and a highest homology with those of GPV/CH/HLJ02/08,which was up to 99%.Pathogenicity research on it showed that its ELD50is 10-6.5/0.2 mL,a very strong virulence.And the strain can be neutralized by standard serum of the GPV.

goose parvirus; isolation and identification; pathogenicity

2013-08-15，

2013-09-24

饒桂波(1987-)，男，安徽阜陽人，碩士，研究方向：動物病毒學(xué)。E-mail:raoguibo@126.com

*[通訊作者]吳健敏(1963-)，女，福建福州人，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：分子病毒學(xué)與傳染病學(xué)。E-mail:wu-jm20@163.com胡桂學(xué)(1963-)，男，吉林長春人，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：動物微生物學(xué)與免疫學(xué)。E-mail:huguixue901103@163.com

S811.6

A

1005-5228(2014)01-0049-05