王樹香　李明　高寶嘉

摘要：采用正交設(shè)計的方法對油松ISSR-PCR反應(yīng)體系5因素（Taq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物的濃度）在4水平上進行優(yōu)化試驗，PCR結(jié)果用SPSS數(shù)據(jù)軟件分析。結(jié)果表明：各因素不同水平對PCR反應(yīng)結(jié)果都有顯著的影響，且除dNTP因素外其他4因素影響均較大；篩選出各反應(yīng)因素的最佳水平，建立油松ISSR-PCR的最佳反應(yīng)體系（20 μL）為：Taq DNA聚合酶1 U、模板5 μg/μL、Mg2+ 2.0 mmol/L、dNTP 0.20 mmol/L、引物0.4 μmol/L；進行梯度退火試驗，篩選出針對不同引物的最適的油松ISSR退火溫度。該優(yōu)化體系的建立為油松及其近緣種的系統(tǒng)學(xué)和種質(zhì)資源鑒定及遺傳多樣性的研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：油松；分子標(biāo)記；ISSR-PCR；反應(yīng)體系；正交設(shè)計

中圖分類號： S722.3 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0046-04

收稿日期：2013-11-01

基金項目：河北省自然科學(xué)基金（編號：C2008000231）；河北農(nóng)業(yè)大學(xué)科研基金（編號：QJ201230）。

作者簡介：王樹香（1977—），女，河北唐山人，碩士，實驗師，主要從事微生物學(xué)、分子生態(tài)學(xué)研究。Tel：（0312）7528256；E-mail：wangshuxiang77@163.com。

通信作者：高寶嘉，博士，教授，主要從事生態(tài)學(xué)、森林有害生物管理研究。E-mail：baojiagao@163.com。油松（Pinus tabulaeformis）為我國特有樹種，是我國溫帶針葉林中主要的建群樹種，在工業(yè)用材、城鎮(zhèn)綠化和荒山造林中具有重要的價值。就目前研究的相關(guān)資料來看，國內(nèi)關(guān)于油松的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的研究較多。如李毳等利用RAPD、ISSR（inter simple sequence repeat，簡單重復(fù)序列區(qū)間）等分子標(biāo)記方法對天然油松群體作了遺傳多樣性分析[1-4]；郝真真等從表觀上對ISSR-PCR進行了優(yōu)化，并研究了油松種群遺傳多樣性和空間遺傳結(jié)構(gòu)特征[5]。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)具有多態(tài)性水平高、可重復(fù)性好、DNA用量少、成本低等優(yōu)點，廣泛用于群體遺傳多樣性分析和種質(zhì)鑒別等研究[6-13]。但是，采用正交設(shè)計的方法對油松ISSR-PCR反應(yīng)體系進行優(yōu)化還無報道，因此，本試驗利用正交設(shè)計從Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物、模板DNA、Mg2+等5個因素4個水平進行分析，優(yōu)化并建立油松ISSR-PCR反應(yīng)體系，從而提高ISSR分析結(jié)果的可靠性和重復(fù)性，為油松品種的分子鑒定、遺傳多樣性分析和品種改良奠定試驗基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

油松選于河北省遼河源國家級森林公園（北緯41°00′～41°10′、東經(jīng)118°30′～118°40′），采集當(dāng)年生針葉置于冰盒中帶回實驗室，置于-70 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。試驗用Taq DNA聚合酶、dNTP購自上海寶生科技發(fā)展有限公司，引物（USB811）由上海寶生科技發(fā)展有限公司合成。

1.2基因組DNA提取和PCR擴增

采用UNIQ-10 柱式新型植物基因組DNA抽提試劑盒[購自生工生物工程（上海）股份有限公司]從油松葉片中提取多株植物基因組總DNA，提取的DNA作為ISSR-PCR反應(yīng)體系的模板。所提DNA樣品的純度和含量用紫外吸收和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3PCR反應(yīng)因素的確定與正交表的設(shè)計

為了確定PCR反應(yīng)中5個因素（Taq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物）的最佳反應(yīng)濃度，采用正交設(shè)計L16（45）于4個水平上進行試驗，每個處理重復(fù)2次，每個處理體積均為20 μL（表1），其中加入2.0 μL無Mg2+的10×Buffer，其他成分按照正交設(shè)計所分析的濃度加入，不足 20 μL 的用超純水補足。16個處理在美國ABI 2720型PCR儀上進行擴增，反應(yīng)程序初步定為：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸7 min；4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠在 3 V/cm 電壓下電泳，電泳結(jié)果采用BIO-RAD Doc-2000自動凝膠成像系統(tǒng)成像，并用SPSS 18.0軟件進行方差分析，進而獲得油松ISSR-PCR最佳反應(yīng)條件。

1.4退火溫度梯度檢測

在正交試驗結(jié)果分析的基礎(chǔ)上，利用擴增儀進行PCR反應(yīng)程序中退火溫度梯度試驗，退火溫度設(shè)置為46～55 ℃，擴增儀自動生成46.0、49.0、52.0、55.0 ℃等4個溫度梯度。所用的PCR擴增體系為正交設(shè)計所得出的最佳體系。

2結(jié)果與分析

2.1電泳結(jié)果評分

正交試驗PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1，獲得的16個處理的譜帶結(jié)果存在很大差異。參照何正文等的方法[14]，依據(jù)譜帶強弱和雜帶的多少對PCR擴增結(jié)果依次打分。其中，條帶數(shù)量多、清晰的擴增結(jié)果計16分，最差的計1分。2次重復(fù)分別獨立統(tǒng)計，16個處理的分?jǐn)?shù)見表1。

2.2各因素對ISSR-PCR反應(yīng)影響的差異分析

將上述處理和評分結(jié)果用SPSS數(shù)據(jù)處理軟件進行方差分析，結(jié)果見表2。由F值可知，模版DNA的濃度對反應(yīng)結(jié)果的影響最大，dNTPs濃度的影響最小，各因素水平變化對PCR反應(yīng)的影響從大到小依次為模板DNA的濃度、Taq DNA聚合酶的濃度、引物的濃度、Mg2+的濃度、dNTPs的濃度。由于各因素水平間的差異除dNTPs和Mg2+的濃度外均達到了顯著水平，可以進一步進行因素內(nèi)水平間的多重比較（表3）。

試驗中模板DNA對反應(yīng)體系影響顯著，這與白錦軍等的研究結(jié)果[15]相似，但與吳根土等的研究結(jié)果[16-17]相反，其原因可能是因為模板DNA中含有酚、多糖等雜質(zhì)，會抑制Taq DNA聚合酶活性，從而影響結(jié)果，因此說明高質(zhì)量的基因組DNA是獲得穩(wěn)定ISSR-PCR結(jié)果的前提。在油松的 ISSR-PCR 反應(yīng)體系中，Taq DNA聚合酶、Mg2+和引物的濃度對PCR擴增結(jié)果影響顯著，這與前人的研究結(jié)果[18-19]相同。本試驗結(jié)果顯示dNTPs的濃度變化對PCR結(jié)果影響不顯著，這不同于其他研究結(jié)果[20-21]，分析其原因可能是單因素梯度試驗結(jié)果的分析未考慮其他因素的交叉影響，造成不可避免的試驗誤差，而本試驗采用正交試驗方差分析，從而提高了分析結(jié)果的可靠性。

本試驗構(gòu)建的油松ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系中，除模板DNA濃度偏高外，Taq DNA聚合酶量、Mg2+濃度、引物濃度、dNTPs濃度均與其他親緣相近樹種相似，如紅松[22]、云南松[23]等。ISSR反應(yīng)對某些物種模板DNA濃度不太敏感，但本研究結(jié)果顯示影響是極顯著的，也與賀佳等的研究結(jié)果[24]相同。退火溫度在減少模板與引物間的非特異性結(jié)合，進而提高PCR反應(yīng)的特異性方面具有重要作用，因此本試驗對篩選出的14條引物逐個進行退火溫度梯度試驗，確定每個引物的最適退火溫度，為以后相似研究提供參考。本試驗優(yōu)化的穩(wěn)定ISSR反應(yīng)體系可以為油松品種選育奠定基礎(chǔ)，同時對油松種質(zhì)資源鑒定、親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域提供科學(xué)依據(jù)。

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本試驗構(gòu)建的油松ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系中，除模板DNA濃度偏高外，Taq DNA聚合酶量、Mg2+濃度、引物濃度、dNTPs濃度均與其他親緣相近樹種相似，如紅松[22]、云南松[23]等。ISSR反應(yīng)對某些物種模板DNA濃度不太敏感，但本研究結(jié)果顯示影響是極顯著的，也與賀佳等的研究結(jié)果[24]相同。退火溫度在減少模板與引物間的非特異性結(jié)合，進而提高PCR反應(yīng)的特異性方面具有重要作用，因此本試驗對篩選出的14條引物逐個進行退火溫度梯度試驗，確定每個引物的最適退火溫度，為以后相似研究提供參考。本試驗優(yōu)化的穩(wěn)定ISSR反應(yīng)體系可以為油松品種選育奠定基礎(chǔ)，同時對油松種質(zhì)資源鑒定、親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域提供科學(xué)依據(jù)。

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本試驗構(gòu)建的油松ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系中，除模板DNA濃度偏高外，Taq DNA聚合酶量、Mg2+濃度、引物濃度、dNTPs濃度均與其他親緣相近樹種相似，如紅松[22]、云南松[23]等。ISSR反應(yīng)對某些物種模板DNA濃度不太敏感，但本研究結(jié)果顯示影響是極顯著的，也與賀佳等的研究結(jié)果[24]相同。退火溫度在減少模板與引物間的非特異性結(jié)合，進而提高PCR反應(yīng)的特異性方面具有重要作用，因此本試驗對篩選出的14條引物逐個進行退火溫度梯度試驗，確定每個引物的最適退火溫度，為以后相似研究提供參考。本試驗優(yōu)化的穩(wěn)定ISSR反應(yīng)體系可以為油松品種選育奠定基礎(chǔ)，同時對油松種質(zhì)資源鑒定、親緣關(guān)系分析、遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建等領(lǐng)域提供科學(xué)依據(jù)。

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