甘源　華利忠　熊祺琰等

摘要：為探索豬肺炎支原體陰性群的培育方法，本試驗(yàn)研究了集成聯(lián)合用藥、SEW和“三點(diǎn)式”飼養(yǎng)管理體系等技術(shù)對(duì)豬肺炎支原體的凈化效果。先通過妊娠母豬的篩選，母豬程序性用藥，SEW技術(shù)，屏障隔離系統(tǒng)，“三點(diǎn)式”生產(chǎn)飼養(yǎng)管理體系及仔豬程序性用藥的培育方法，再通過豬肺炎支原體血清抗體檢測和熒光定量PCR檢測鼻拭子的方法對(duì)所培育的仔豬進(jìn)行長達(dá)4個(gè)月的監(jiān)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新培育的5批豬在35日齡后血清抗體均為陰性，鼻拭子抗原檢測全為陰性。結(jié)果表明集成聯(lián)合用藥、SEW和“三點(diǎn)式”生產(chǎn)管理體系技術(shù)可以有效凈化豬肺炎支原體，為國內(nèi)豬氣喘病的控制和凈化提供理論基礎(chǔ)及臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

關(guān)鍵詞：SEW；早期斷奶；屏障系統(tǒng)；“三點(diǎn)式”生產(chǎn)飼養(yǎng)管理體系；藥物凈化；生物安全

中圖分類號(hào)： S852.3；S858.286.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0197-04

收稿日期：2013-12-20

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（13）3076]。

作者簡介：甘源（1984—），男，湖北荊州人，碩士，從事動(dòng)物重大疫病研究。E-mail：ganyuan19868@163.com。

通信作者：邵國青，研究員。E-mail：gqshaojaas@gmail.com。豬支原體肺炎（mycoplasmal pneumonia of swine，MPS）又稱豬地方流行性肺炎、豬氣喘病，是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）感染引起的一種慢性呼吸道傳染病，也是世界上最主要的豬病之一[1]，以咳嗽、喘氣和生長發(fā)育遲緩為主要臨床特征[2]。Mhp可通過直接接觸或氣溶膠傳播[3-4]，其傳播距離可達(dá)4.7 km[5]，極難防控。美國豬場45%的防疫費(fèi)用于購買豬支原體肺炎滅活疫苗，但仍不能完全控制。近幾年來，我國養(yǎng)豬業(yè)向集約化、規(guī)?；l(fā)展速度迅猛，由于國內(nèi)大多數(shù)豬場管理不到位，生物安全重視程度不夠，區(qū)域內(nèi)豬場密度大，豬場內(nèi)養(yǎng)殖密度大、生豬運(yùn)輸頻繁等因素，加大了豬肺炎支原體的傳播和感染，不僅降低各種參數(shù)，如降低飼料報(bào)酬延長了感染豬至出欄體重的生長時(shí)間，而且導(dǎo)致抗生素濫用，加大了養(yǎng)豬成本和給食品安全帶來危害，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的損失。如何經(jīng)濟(jì)有效地控制豬氣喘病一直是困擾全球養(yǎng)豬業(yè)的難題，研究表明控制該病的最好方法是從源頭抓起徹底凈化病原。

早在1970年Juhr等就報(bào)道了無支原體肺炎的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的控制方法[6]，20世紀(jì)70年代末至80年代初，英國Alerander等也創(chuàng)造了一種消滅豬病的新方法-MEW技術(shù)（治療性早期斷奶技術(shù)），緊接著20世紀(jì)90年代初期美國養(yǎng)豬界Dritz等又試行了一種隔離式早期斷奶技術(shù)（segregated early weaning，SEW）。目前，美國60%的豬群都推行SEW，在日本和我國的臺(tái)灣省、廣東省也都進(jìn)行了嘗試。紀(jì)孫輝等的研究表明，用早期隔離斷奶技術(shù)能使支原體陽性率下降68%[7]，說明使用SEW技術(shù)對(duì)防控豬氣喘病有一定的效果，但并不能徹底凈化病原，需要其他技術(shù)的輔助。后來國內(nèi)外研究又探索了一些支原體的凈化方法，其中瑞士減群法、程序性用藥、早期藥物隔離斷奶技術(shù)和封群等技術(shù)比較流行[8]。西歐很多豬場在實(shí)施瑞士減群法凈化Mhp時(shí)就用以延胡索酸泰妙菌素為主的用藥方案。Alfonso等利用藥物早期隔離斷奶技術(shù)聯(lián)合多點(diǎn)式生產(chǎn)模式成功凈化了一個(gè)1 700頭母豬豬場的肺炎支原體[9]，而這些方法最關(guān)鍵的是制定科學(xué)合理的凈化措施。

針對(duì)目前豬肺炎支原體防控日益嚴(yán)峻的形勢，本研究在結(jié)合對(duì)豬肺炎支原體防控及致病機(jī)理研究成果的基礎(chǔ)上，借鑒前人的研究經(jīng)驗(yàn)，聯(lián)合運(yùn)用MEW及“三點(diǎn)式”生產(chǎn)體系培育豬氣喘病陰性群，通過為健康種豬核心群提供豬氣喘病陰性種豬，從源頭上控制和凈化豬氣喘病，為國內(nèi)豬氣喘病的防控和凈化提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要設(shè)備屏障系統(tǒng)：正壓無菌動(dòng)物房及隔離飼養(yǎng)器（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國Life Technologies公司）；無菌奶槽；排泄物處理裝置；乳豬無菌運(yùn)輸箱等。

1.1.2主要試劑豬瘟ELISA抗體檢測試劑盒、豬藍(lán)耳病ELISA抗體檢測試劑盒、豬偽狂犬gE ELISA抗體檢測試劑盒和豬肺炎支原體血清抗體檢測試劑盒購自美國愛德士生物科技公司；豬圓環(huán)病毒2型ELISA抗體檢測試劑盒購自武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司；口蹄疫ELISA抗體檢測試劑盒購自韓國金諾；Premix Ex TaqTM為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.1.3試驗(yàn)動(dòng)物每批次選擇常州某豬場3胎以上妊娠中期，支原體抗原抗體為陽性的無臨床癥狀母豬和所產(chǎn)仔豬若干頭。 共選取5批次。

1.1.4菌株及質(zhì)粒載體Mhp菌株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所家畜重大疫病組保存。重組質(zhì)粒pMD18-T/P97由江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所家畜重大疫病組制備。

1.1.5主要飼料和藥品市售配方奶粉、教槽料購自江蘇安佑科技飼料有限公司；80%泰妙菌素和鹽酸多西環(huán)素購自上海諾華動(dòng)物保健有限公司；復(fù)合電解多維、甲醛、聚維酮碘、2%過氧乙酸、生石灰、葡萄糖水為常規(guī)藥品或試劑。

1.2方法

1.2.1“三點(diǎn)式”飼養(yǎng)模式飼養(yǎng)地點(diǎn)的選擇及生物安全管理采用“三點(diǎn)式”生產(chǎn)體系[10-12]飼養(yǎng)技術(shù)和部分SPF管理技術(shù)[13]：其中A地點(diǎn)是支原體陽性場，B地點(diǎn)為正壓無菌動(dòng)物房及隔離飼養(yǎng)器，C地點(diǎn)為無疫病且具有優(yōu)良的地理性隔離飼養(yǎng)點(diǎn)，根據(jù)最新研究發(fā)現(xiàn)豬肺炎支原體病原的傳播距離可遠(yuǎn)至4.7 km[5]，固A、B、C這3個(gè)地點(diǎn)相距直線距離不少于 5 km 且飼養(yǎng)點(diǎn)周圍5 km之內(nèi)沒有其他豬場和屠宰場，每個(gè)飼養(yǎng)點(diǎn)遠(yuǎn)離交通要道和人物流動(dòng)性大的區(qū)域以避免引進(jìn)新的病原，以針對(duì)飼養(yǎng)管理建立一個(gè)綜合的生物安全體系（圖1）。endprint

1.2.2陽性A場母豬群的篩選及產(chǎn)前預(yù)處理采集假定支原體肺炎陽性場的妊娠母豬群的血樣和鼻拭子樣本，通過熒光定量PCR及ELISA方法篩選抗原抗體陽性母豬群，確定試驗(yàn)動(dòng)物來源，確定的支原體陽性場設(shè)定為A場；在A地點(diǎn)選擇妊娠后期母豬，豬肺炎支原體陽性種豬群于產(chǎn)前20 d給藥，80%泰妙菌素125 g/t+鹽酸多西環(huán)素150 g/t +阿莫西林200 g/t，連續(xù)用藥2周，產(chǎn)前1周停藥。接產(chǎn)室每天用聚維酮碘500倍液噴霧消毒3次。預(yù)產(chǎn)前母豬全身消毒后送入消毒好的產(chǎn)房待產(chǎn)，并認(rèn)真做好初乳仔豬的日常護(hù)理工作。在A場每批次隨機(jī)挑選不做以上處理的母豬分娩的仔豬共10頭設(shè)為對(duì)照組，標(biāo)記、樣品采集、抗原抗體檢測（監(jiān)測）同步進(jìn)行。

1.2.3運(yùn)用SEW獲得仔豬在B地點(diǎn)隔離屏障系統(tǒng)內(nèi)的飼養(yǎng)管理從陽性A地點(diǎn)挑選出健康狀況良好的7日齡仔豬，采用無菌轉(zhuǎn)運(yùn)箱轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)離母豬源的B地點(diǎn)隔離飼養(yǎng)，B地點(diǎn)的飼養(yǎng)環(huán)境為安裝空氣過濾屏障系統(tǒng)房間，并嚴(yán)格控制溫濕度，嚴(yán)格執(zhí)行隔離器飼養(yǎng)仔豬的日常管理制度。在轉(zhuǎn)群和飼養(yǎng)的過程中嚴(yán)格消毒并注意生物安全，遵照飼養(yǎng)管理程序做好日常保健及除豬肺炎支原體外的其他疫苗免疫工作，補(bǔ)鐵補(bǔ)鋅、打耳號(hào)等。在飼養(yǎng)期間給予豬肺炎支原體敏感抗生素藥物凈化，即：1 L安佑產(chǎn)“奶媽奶”或1 kg教槽料中拌藥：80%泰妙菌素1 g+電解多維4 g，連用直至35日齡轉(zhuǎn)群至C地點(diǎn)。

1.2.4C地點(diǎn)隔離飼養(yǎng)方式遵照抗原抗體檢測（監(jiān)測）結(jié)果，從B地點(diǎn)挑選出健康狀況良好的35日齡的仔豬，采用無菌轉(zhuǎn)運(yùn)箱轉(zhuǎn)移至C地點(diǎn)隔離飼養(yǎng)，C地點(diǎn)安排有飼養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)的專人駐點(diǎn)飼養(yǎng)，在轉(zhuǎn)群和飼養(yǎng)的過程中嚴(yán)格消毒并注意生物安全，遵照飼養(yǎng)管理程序做好日常保健及除豬肺炎支原體外的其他疫苗免疫工作。

1.2.5具體藥物凈化程序的制定及實(shí)施方法A地點(diǎn)：所有種豬（種公豬和種母豬）：1 t飼料中拌藥：80%泰妙菌素 125 g+15%金霉素2 000 g +電解多維400 g，產(chǎn)前20 d給藥，連續(xù)用藥2周，產(chǎn)前1周停藥。B地點(diǎn)：7日齡早期斷奶直至35日齡轉(zhuǎn)群，1 L“代母乳”或1 kg教槽料中拌藥：80%泰妙菌素 1 g+電解多維4 g，連用直至35日齡轉(zhuǎn)群至C地點(diǎn)。C地點(diǎn)：所有豬群，1 t飼料中拌藥：80%泰妙菌素125 g+電解多維400 g，轉(zhuǎn)群后連用7 d后停藥，每月月初用藥7 d，擴(kuò)繁用種豬產(chǎn)前和配種前1周停藥。

1.2.6豬肺炎支原體血清抗體檢測A場對(duì)照組和B場、C場試驗(yàn)組于21、35、75、120日齡采集血樣，運(yùn)用血清學(xué)方法，即：運(yùn)用美國IDEXX ELISA檢測試劑盒監(jiān)測血清中豬肺炎支原體特異性抗體。淘汰抗體陽性豬群。以后每隔1個(gè)月用同樣方法采集樣品進(jìn)行監(jiān)測。如有抗體陽性群，則整窩淘汰。另外，嚴(yán)格按操作說明檢測豬瘟、藍(lán)耳病、偽狂犬等疫苗抗體，如果有不符合要求的豬只及時(shí)補(bǔ)打疫苗或者淘汰處理。

1.2.7豬肺炎支原體鼻拭子樣品抗原檢測按照“1.2.6”的時(shí)間同步采集鼻拭子樣品，運(yùn)用分子生物學(xué)方法，即：按馮志新等的方法[14]處理鼻拭子樣品，用已建立的熒光定量PCR[15]檢測豬肺炎支原體病原監(jiān)測鼻拭子中的豬肺炎支原體病原。淘汰病原陽性群。以后每隔1個(gè)月用同樣方法采集樣品檢測（監(jiān)測）1次。如有陽性群，則整窩淘汰。

1.2.8日常管理建立完善的日常記錄臺(tái)賬及定期對(duì)試驗(yàn)豬群的血清學(xué)及分子生物學(xué)檢測（監(jiān)測）結(jié)果進(jìn)行整理，建立凈化檔案，每一次轉(zhuǎn)群都做到全進(jìn)全出。每周定期對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行徹底清洗消毒，使用3種消毒液交替使用，定期滅鼠滅蚊，全群驅(qū)蟲。

1.2.9豬肺炎支原體凈化方法本次研究豬肺炎支原體凈化方法如圖1所示。

2結(jié)果與分析

2.1培育豬群和對(duì)照豬群樣品抗原檢測結(jié)果

定期對(duì)上述5批培育豬和對(duì)照豬群所采集的血清和鼻拭子樣品進(jìn)行檢測（監(jiān)測），由表1可知試驗(yàn)豬群的抗原檢測（監(jiān)測）結(jié)果全為陰性，對(duì)照豬群抗原檢測結(jié)果全為陽性，表明該凈化方法可以有效切斷支原體病原的水平和垂直傳播。

2.2培育豬群和對(duì)照豬群的樣品抗體檢測（監(jiān)測）結(jié)果

3.3運(yùn)用程序性用藥、SEW和“三點(diǎn)式”生產(chǎn)體系技術(shù)培育豬氣喘病陰性群的關(guān)鍵點(diǎn)

本方法對(duì)仔豬7日齡進(jìn)行早期隔離斷奶后就將其轉(zhuǎn)入正壓無菌動(dòng)物房內(nèi)的物理性隔離器內(nèi)飼養(yǎng)，使用的隔離器特征在于三級(jí)空氣凈化屏障系統(tǒng)為高效正壓系統(tǒng)，通過三級(jí)高效的0.2 μm的通風(fēng)過濾膜將攜帶豬肺炎支原體的氣溶膠屏障在外，屏障系統(tǒng)特點(diǎn)為：能夠很好地控制溫濕度，投喂飼料、糞便收集、消毒及清理方便，對(duì)豬肺炎支原體凈化具有很好的效果，大大降低了豬群通過呼吸攜帶致病因子的氣溶膠而感染豬肺炎支原體的概率；但在實(shí)際生產(chǎn)中很難有這樣的潔凈條件，我們將在下一步的試驗(yàn)中遵循實(shí)際推廣的要求逐一簡化。

生產(chǎn)出豬氣喘病陰性群后，對(duì)它的維持至關(guān)重要。國內(nèi)外凈化支原體的技術(shù)難點(diǎn)及凈化失敗的原因并不在生產(chǎn)豬氣喘病陰性群上，主要是在陰性群維持上[16]，它是一個(gè)復(fù)雜、長期和艱巨的任務(wù)。維持的技術(shù)手段主要有科學(xué)的飼養(yǎng)管理體系、藥物控制及疫苗免疫這三方面內(nèi)容。同時(shí)良好的地理隔離環(huán)境和生物安全保障也是成功凈化豬肺炎支原體的一個(gè)重要因素。

在對(duì)于陽性母豬群降低或減少對(duì)下一代仔豬的疫病垂直傳播和水平傳播的方法上，國內(nèi)也有不少專家做過各種相應(yīng)的研究，袁國華等利用自然分娩的方法也能夠有效阻止豬肺炎支原體病原的傳播[17]，這些方法都是基于不同疫病母源抗體為仔豬提供的被動(dòng)免疫保護(hù)能力持續(xù)時(shí)間不同來實(shí)施的。而只有在母源抗體的有效保護(hù)時(shí)間內(nèi)斷奶并隔離飼養(yǎng)，才能切斷病原的垂直傳播。

最后，在建立本研究方法之前，我們建立了詳盡的試驗(yàn)方案、優(yōu)良的試驗(yàn)條件及相關(guān)的準(zhǔn)備工作。從本試驗(yàn)結(jié)果來看，運(yùn)用程序性用藥、SEW和“三點(diǎn)式”生產(chǎn)體系技術(shù)培育豬氣喘病陰性群的方法是可行的，此研究為豬肺炎支原體的凈化提供了新的方法及事實(shí)論證。我們下一步研究計(jì)劃是在推廣該方法的同時(shí)繼續(xù)簡化各種操作程序及降低運(yùn)行成本，以便更易于該方法的實(shí)際推廣與運(yùn)用。endprint

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