響應(yīng)面法優(yōu)化耐熱植酸酶產(chǎn)生菌發(fā)酵培養(yǎng)基

陳璨　張菊　常云霞等

摘要：在單因素法初步優(yōu)化試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行了Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)以及響應(yīng)面分析（采用Box-Behnken法）進(jìn)一步優(yōu)化了菌株zk1266的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，得到最佳培養(yǎng)基組分為：胰蛋白胨3.06%，葡萄糖385%，氯化鉀0.27%，氯化鈉0.05%，MgSO4·7H2O 0.1%，CaCl2·2H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005%，用此培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，菌株所產(chǎn)耐熱植酸酶酶活為141.26 U/mL。菌株產(chǎn)酶能力比優(yōu)化前有了較大提高。

關(guān)鍵詞：植酸酶；Plackett-Burman設(shè)計(jì)；Box-Behnken設(shè)計(jì)；響應(yīng)曲面

中圖分類號(hào)： Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0391-03

收稿日期：2013-10-26

基金項(xiàng)目：周口師范學(xué)院青年科研基金（編號(hào)：2012QNA04）。

作者簡介：陳璨（1985—），男，河南周口人，碩士，講師，主要從事分子與微生物學(xué)研究。E-mail：chenc02@126.com。

通信作者：陳龍，教授，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail：chenlongzg@126.com。植酸酶（phytase）是催化植酸及植酸鹽水解成磷酸（或磷酸鹽）、肌醇的一類酶[1-3]。因其可解決植酸帶來的環(huán)境及營養(yǎng)問題，植酸酶已成為飼料、酶制劑及食品添加劑領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4-6]。植酸酶可代替飼料原料中所添加的大量無機(jī)磷（磷酸氫鈣等），不僅可以解決我國磷資源供應(yīng)不足的問題，還可以減少生產(chǎn)無機(jī)磷的工廠數(shù)量[7]。用添加植酸酶的飼料喂養(yǎng)動(dòng)物可有效減少其糞便中的磷含量，進(jìn)而可解決因磷含量過多導(dǎo)致的土壤板結(jié)及水質(zhì)下降等問題，改善農(nóng)村農(nóng)田環(huán)境。工業(yè)制備植酸酶時(shí)，在高溫制粒這一環(huán)節(jié)中，植酸酶的熱穩(wěn)定性較差，嚴(yán)重影響植酸酶的工業(yè)化生產(chǎn)，因此進(jìn)行耐熱植酸酶篩選顯得十分重要。筆者所在試驗(yàn)室篩選到1株耐熱植酸酶產(chǎn)生菌。本研究以響應(yīng)面法優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基，提高其耐熱植酸酶的活力，旨在為植酸酶工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

菌株zk1266分離自農(nóng)村堆肥。

1.2培養(yǎng)基

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖5%，牛肉膏2%，氯化鈉005%，蒸餾水定容至100 mL，pH值自然。初始產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5%，牛肉膏2%，氯化鈉0.05%，氯化鉀005%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2·2H2O 0.05%，MnSO4·4H2O 0.01%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01%，蒸餾水定容至100 mL，pH值自然。

1.3方法

1.3.1酶活測(cè)定方法裝液量100 mL，接種量6%，45 ℃ 180 r/min培養(yǎng)50 h后測(cè)酶活，每組做3個(gè)平行，結(jié)果取平均值。參照葉冰等的酶活測(cè)定方法[8]測(cè)定植酸酶活性。

1.3.2Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出對(duì)酶活影響顯著的因子。裝液量100 mL，接種量6%，45 ℃ 180 r/min培養(yǎng)50 h后測(cè)酶活，每組做3個(gè)平行，結(jié)果取平均值。

1.3.3最陡爬坡試驗(yàn)根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出的顯著因子效應(yīng)大小，設(shè)計(jì)它們的步長，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，確定試驗(yàn)因素中心點(diǎn)，找到產(chǎn)酶活性最高的區(qū)域。參照“131”節(jié)的方法測(cè)酶活性。

1.3.4響應(yīng)面分析采用Box-Behnken法，根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)確定的試驗(yàn)因素中心點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面因素及水平。采用Minitab 15軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次線性回歸方程，分析各因素的主效應(yīng)、交互效應(yīng)，在一定水平范圍內(nèi)求最佳值，最后通過試驗(yàn)來驗(yàn)證模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值是否吻合、模型是否合理。參照“1.3.1”節(jié)的方法測(cè)酶活性。

2結(jié)果與分析

2.1Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)，從6個(gè)影響因素中篩選出具有顯著影響的因素。每個(gè)因素取2個(gè)水平：即高水平（+1）、低水平（-1）。由表1可知，葡萄糖、胰蛋白胨、氯化鉀是影響顯著的因素。

3結(jié)論

本研究表明，培養(yǎng)基最佳成分為：胰蛋白胨3.06%，葡萄糖3.85%，氯化鉀0.27%，氯化鈉0.05%，MgSO4·7H2O 01%，CaCl2·2H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005%，用此培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，菌株所產(chǎn)耐熱植酸酶酶活為141.26 U/mL。經(jīng)過對(duì)產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化后，菌株zk1266的發(fā)酵產(chǎn)酶活力有了較明顯的提高。45 ℃下，本試驗(yàn)所用菌株zk1266能正常生長，若用其進(jìn)行放大培養(yǎng)及進(jìn)一步的工業(yè)生產(chǎn)，可以減少生產(chǎn)中污染雜菌的概率。

參考文獻(xiàn)：

[1]Mullaney E J，Ullah A H. The term phytase comprises several different classes of enzymes[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2003，312（1）：179-184.

[2]Wodzinski R J，Ullah A. Phytase[J]. Advances in Applied Microbiology，1996，42：263-302.

[3]陳育如，劉友芬，郭月霞，等. 秸稈降解微生物在不同培養(yǎng)基中的產(chǎn)植酸酶特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（2）：210-212.

[4]Cao L，Wang W M，Yang C T，et al. Application of microbial phytase in fish feed[J]. Enzyme and Microbial Technology，2007，40（4）：497-507.

[5]周建琴，劉菊香. 聚乙烯醇復(fù)合固定化植酸酶方法研究[J]. 中國釀造，2009（11）：112-115.

[6]董其國，徐穩(wěn)，王恬. 不同劑量植酸酶對(duì)生長育肥豬生產(chǎn)性能和飼料養(yǎng)分利用率的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（4）：215-218.

[7]張莉，趙耘，王郡美. 植酸酶在飼料工業(yè)中的應(yīng)用及其研究進(jìn)展[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息，2006（8）：7-9.

[8]葉冰，王運(yùn)吉，張苓花. 植酸酶畢赤酵母基因工程菌高密度發(fā)酵[J]. 大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，21（3）：193-196.endprint

摘要：在單因素法初步優(yōu)化試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行了Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)以及響應(yīng)面分析（采用Box-Behnken法）進(jìn)一步優(yōu)化了菌株zk1266的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，得到最佳培養(yǎng)基組分為：胰蛋白胨3.06%，葡萄糖385%，氯化鉀0.27%，氯化鈉0.05%，MgSO4·7H2O 0.1%，CaCl2·2H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005%，用此培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，菌株所產(chǎn)耐熱植酸酶酶活為141.26 U/mL。菌株產(chǎn)酶能力比優(yōu)化前有了較大提高。

關(guān)鍵詞：植酸酶；Plackett-Burman設(shè)計(jì)；Box-Behnken設(shè)計(jì)；響應(yīng)曲面

中圖分類號(hào)： Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0391-03

收稿日期：2013-10-26

基金項(xiàng)目：周口師范學(xué)院青年科研基金（編號(hào)：2012QNA04）。

作者簡介：陳璨（1985—），男，河南周口人，碩士，講師，主要從事分子與微生物學(xué)研究。E-mail：chenc02@126.com。

通信作者：陳龍，教授，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail：chenlongzg@126.com。植酸酶（phytase）是催化植酸及植酸鹽水解成磷酸（或磷酸鹽）、肌醇的一類酶[1-3]。因其可解決植酸帶來的環(huán)境及營養(yǎng)問題，植酸酶已成為飼料、酶制劑及食品添加劑領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4-6]。植酸酶可代替飼料原料中所添加的大量無機(jī)磷（磷酸氫鈣等），不僅可以解決我國磷資源供應(yīng)不足的問題，還可以減少生產(chǎn)無機(jī)磷的工廠數(shù)量[7]。用添加植酸酶的飼料喂養(yǎng)動(dòng)物可有效減少其糞便中的磷含量，進(jìn)而可解決因磷含量過多導(dǎo)致的土壤板結(jié)及水質(zhì)下降等問題，改善農(nóng)村農(nóng)田環(huán)境。工業(yè)制備植酸酶時(shí)，在高溫制粒這一環(huán)節(jié)中，植酸酶的熱穩(wěn)定性較差，嚴(yán)重影響植酸酶的工業(yè)化生產(chǎn)，因此進(jìn)行耐熱植酸酶篩選顯得十分重要。筆者所在試驗(yàn)室篩選到1株耐熱植酸酶產(chǎn)生菌。本研究以響應(yīng)面法優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基，提高其耐熱植酸酶的活力，旨在為植酸酶工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

菌株zk1266分離自農(nóng)村堆肥。

1.2培養(yǎng)基

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖5%，牛肉膏2%，氯化鈉005%，蒸餾水定容至100 mL，pH值自然。初始產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5%，牛肉膏2%，氯化鈉0.05%，氯化鉀005%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2·2H2O 0.05%，MnSO4·4H2O 0.01%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01%，蒸餾水定容至100 mL，pH值自然。

1.3方法

1.3.1酶活測(cè)定方法裝液量100 mL，接種量6%，45 ℃ 180 r/min培養(yǎng)50 h后測(cè)酶活，每組做3個(gè)平行，結(jié)果取平均值。參照葉冰等的酶活測(cè)定方法[8]測(cè)定植酸酶活性。

1.3.2Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出對(duì)酶活影響顯著的因子。裝液量100 mL，接種量6%，45 ℃ 180 r/min培養(yǎng)50 h后測(cè)酶活，每組做3個(gè)平行，結(jié)果取平均值。

1.3.3最陡爬坡試驗(yàn)根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出的顯著因子效應(yīng)大小，設(shè)計(jì)它們的步長，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，確定試驗(yàn)因素中心點(diǎn)，找到產(chǎn)酶活性最高的區(qū)域。參照“131”節(jié)的方法測(cè)酶活性。

1.3.4響應(yīng)面分析采用Box-Behnken法，根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)確定的試驗(yàn)因素中心點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面因素及水平。采用Minitab 15軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次線性回歸方程，分析各因素的主效應(yīng)、交互效應(yīng)，在一定水平范圍內(nèi)求最佳值，最后通過試驗(yàn)來驗(yàn)證模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值是否吻合、模型是否合理。參照“1.3.1”節(jié)的方法測(cè)酶活性。

2結(jié)果與分析

2.1Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)，從6個(gè)影響因素中篩選出具有顯著影響的因素。每個(gè)因素取2個(gè)水平：即高水平（+1）、低水平（-1）。由表1可知，葡萄糖、胰蛋白胨、氯化鉀是影響顯著的因素。

3結(jié)論

本研究表明，培養(yǎng)基最佳成分為：胰蛋白胨3.06%，葡萄糖3.85%，氯化鉀0.27%，氯化鈉0.05%，MgSO4·7H2O 01%，CaCl2·2H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005%，用此培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，菌株所產(chǎn)耐熱植酸酶酶活為141.26 U/mL。經(jīng)過對(duì)產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化后，菌株zk1266的發(fā)酵產(chǎn)酶活力有了較明顯的提高。45 ℃下，本試驗(yàn)所用菌株zk1266能正常生長，若用其進(jìn)行放大培養(yǎng)及進(jìn)一步的工業(yè)生產(chǎn)，可以減少生產(chǎn)中污染雜菌的概率。

參考文獻(xiàn)：

[1]Mullaney E J，Ullah A H. The term phytase comprises several different classes of enzymes[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2003，312（1）：179-184.

[2]Wodzinski R J，Ullah A. Phytase[J]. Advances in Applied Microbiology，1996，42：263-302.

[3]陳育如，劉友芬，郭月霞，等. 秸稈降解微生物在不同培養(yǎng)基中的產(chǎn)植酸酶特性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（2）：210-212.

[4]Cao L，Wang W M，Yang C T，et al. Application of microbial phytase in fish feed[J]. Enzyme and Microbial Technology，2007，40（4）：497-507.

[5]周建琴，劉菊香. 聚乙烯醇復(fù)合固定化植酸酶方法研究[J]. 中國釀造，2009（11）：112-115.

[6]董其國，徐穩(wěn)，王恬. 不同劑量植酸酶對(duì)生長育肥豬生產(chǎn)性能和飼料養(yǎng)分利用率的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（4）：215-218.

[7]張莉，趙耘，王郡美. 植酸酶在飼料工業(yè)中的應(yīng)用及其研究進(jìn)展[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息，2006（8）：7-9.

[8]葉冰，王運(yùn)吉，張苓花. 植酸酶畢赤酵母基因工程菌高密度發(fā)酵[J]. 大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，21（3）：193-196.endprint

摘要：在單因素法初步優(yōu)化試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行了Plackett-Burman試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)以及響應(yīng)面分析（采用Box-Behnken法）進(jìn)一步優(yōu)化了菌株zk1266的發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基，得到最佳培養(yǎng)基組分為：胰蛋白胨3.06%，葡萄糖385%，氯化鉀0.27%，氯化鈉0.05%，MgSO4·7H2O 0.1%，CaCl2·2H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005%，用此培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，菌株所產(chǎn)耐熱植酸酶酶活為141.26 U/mL。菌株產(chǎn)酶能力比優(yōu)化前有了較大提高。

關(guān)鍵詞：植酸酶；Plackett-Burman設(shè)計(jì)；Box-Behnken設(shè)計(jì)；響應(yīng)曲面

中圖分類號(hào)： Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0391-03

收稿日期：2013-10-26

基金項(xiàng)目：周口師范學(xué)院青年科研基金（編號(hào)：2012QNA04）。

作者簡介：陳璨（1985—），男，河南周口人，碩士，講師，主要從事分子與微生物學(xué)研究。E-mail：chenc02@126.com。

通信作者：陳龍，教授，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。E-mail：chenlongzg@126.com。植酸酶（phytase）是催化植酸及植酸鹽水解成磷酸（或磷酸鹽）、肌醇的一類酶[1-3]。因其可解決植酸帶來的環(huán)境及營養(yǎng)問題，植酸酶已成為飼料、酶制劑及食品添加劑領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4-6]。植酸酶可代替飼料原料中所添加的大量無機(jī)磷（磷酸氫鈣等），不僅可以解決我國磷資源供應(yīng)不足的問題，還可以減少生產(chǎn)無機(jī)磷的工廠數(shù)量[7]。用添加植酸酶的飼料喂養(yǎng)動(dòng)物可有效減少其糞便中的磷含量，進(jìn)而可解決因磷含量過多導(dǎo)致的土壤板結(jié)及水質(zhì)下降等問題，改善農(nóng)村農(nóng)田環(huán)境。工業(yè)制備植酸酶時(shí)，在高溫制粒這一環(huán)節(jié)中，植酸酶的熱穩(wěn)定性較差，嚴(yán)重影響植酸酶的工業(yè)化生產(chǎn)，因此進(jìn)行耐熱植酸酶篩選顯得十分重要。筆者所在試驗(yàn)室篩選到1株耐熱植酸酶產(chǎn)生菌。本研究以響應(yīng)面法優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基，提高其耐熱植酸酶的活力，旨在為植酸酶工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

菌株zk1266分離自農(nóng)村堆肥。

1.2培養(yǎng)基

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖5%，牛肉膏2%，氯化鈉005%，蒸餾水定容至100 mL，pH值自然。初始產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5%，牛肉膏2%，氯化鈉0.05%，氯化鉀005%，MgSO4·7H2O 0.05%，CaCl2·2H2O 0.05%，MnSO4·4H2O 0.01%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01%，蒸餾水定容至100 mL，pH值自然。

1.3方法

1.3.1酶活測(cè)定方法裝液量100 mL，接種量6%，45 ℃ 180 r/min培養(yǎng)50 h后測(cè)酶活，每組做3個(gè)平行，結(jié)果取平均值。參照葉冰等的酶活測(cè)定方法[8]測(cè)定植酸酶活性。

1.3.2Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出對(duì)酶活影響顯著的因子。裝液量100 mL，接種量6%，45 ℃ 180 r/min培養(yǎng)50 h后測(cè)酶活，每組做3個(gè)平行，結(jié)果取平均值。

1.3.3最陡爬坡試驗(yàn)根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出的顯著因子效應(yīng)大小，設(shè)計(jì)它們的步長，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，確定試驗(yàn)因素中心點(diǎn)，找到產(chǎn)酶活性最高的區(qū)域。參照“131”節(jié)的方法測(cè)酶活性。

1.3.4響應(yīng)面分析采用Box-Behnken法，根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)確定的試驗(yàn)因素中心點(diǎn)設(shè)計(jì)響應(yīng)面因素及水平。采用Minitab 15軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次線性回歸方程，分析各因素的主效應(yīng)、交互效應(yīng)，在一定水平范圍內(nèi)求最佳值，最后通過試驗(yàn)來驗(yàn)證模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值是否吻合、模型是否合理。參照“1.3.1”節(jié)的方法測(cè)酶活性。

2結(jié)果與分析

2.1Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)，從6個(gè)影響因素中篩選出具有顯著影響的因素。每個(gè)因素取2個(gè)水平：即高水平（+1）、低水平（-1）。由表1可知，葡萄糖、胰蛋白胨、氯化鉀是影響顯著的因素。

3結(jié)論

本研究表明，培養(yǎng)基最佳成分為：胰蛋白胨3.06%，葡萄糖3.85%，氯化鉀0.27%，氯化鈉0.05%，MgSO4·7H2O 01%，CaCl2·2H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005%，用此培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行培養(yǎng)，菌株所產(chǎn)耐熱植酸酶酶活為141.26 U/mL。經(jīng)過對(duì)產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化后，菌株zk1266的發(fā)酵產(chǎn)酶活力有了較明顯的提高。45 ℃下，本試驗(yàn)所用菌株zk1266能正常生長，若用其進(jìn)行放大培養(yǎng)及進(jìn)一步的工業(yè)生產(chǎn)，可以減少生產(chǎn)中污染雜菌的概率。

參考文獻(xiàn)：

[1]Mullaney E J，Ullah A H. The term phytase comprises several different classes of enzymes[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，2003，312（1）：179-184.

[2]Wodzinski R J，Ullah A. Phytase[J]. Advances in Applied Microbiology，1996，42：263-302.

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