姜爭 劉彥龍 王錫山
細(xì)胞周期對(duì)于維持細(xì)胞的正常生長發(fā)育分化是必須的,其各個(gè)水平都受到多種因子的嚴(yán)格調(diào)控以確保其正常進(jìn)行,其中去泛素化酶也是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子。細(xì)胞周期中許多重要的調(diào)控因子如細(xì)胞周期蛋白激酶CDKs和蛋白激酶抑制因子等均通過泛素化,進(jìn)而由蛋白酶體降解。去泛素化酶可在蛋白酶體上將底物蛋白的泛素分子解離出來再循環(huán),從而維持泛素水平與蛋白酶體功能穩(wěn)定,控制細(xì)胞周期調(diào)控因子的活性和功能,這一類去泛素化酶又被稱為管家去泛素化酶。有些去泛素化酶是通過調(diào)控泛素連接酶的穩(wěn)定性和活性來發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用。去泛素化酶還可以通過影響細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定性發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞周期的作用。關(guān)于USP22如何調(diào)控細(xì)胞周期的機(jī)制并不明了。本文著重探討了USP22與可能靶點(diǎn)之間的聯(lián)系,以期初步確定USP22調(diào)控細(xì)胞周期的機(jī)制。
選取哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬三院2006至2007年間手術(shù)切除的82例結(jié)直腸癌患者的新鮮組織作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,包括癌旁黏膜82例及其相配對(duì)的腺癌82例。同時(shí)收集研究病例的臨床病理資料,包括患者的年齡、性別、分化程度、腫瘤大小、浸潤深度及有無淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等。
1.儀器與試劑:二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱、熒光定量PCR儀、凝膠成像分析儀、水浴搖床、超純水儀。USP22、BMI-1、c-Myc、cyclin D2、p14ARF、p16INK4a、GAPDH探針購自于美國Applied Biosystems公司。定量PCR相關(guān)試劑:RNA抽提試劑盒(上海生工)、TRIzol試劑(Invitrogen)、High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Applied Biosystems)、TaqMan?Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)。
2.USP22及其靶點(diǎn)的mRNA檢測:采用RT-PCR法,按試劑盒操作說明書分別提取總RNA 1 μg,RNA水平(μg/ml)=稀釋倍數(shù)×OD260值×40。RT-PCR反應(yīng)體系:0.1 μg/μl cDNA 2.0 μL,上下游引物各0.5 μL,TaqMan?Universal PCR Master Mix 10 μl,加雙蒸水(ddH2O)至20 μl。擴(kuò)增條件:先95℃預(yù)變性10 min;接著進(jìn)行40個(gè)循環(huán),包括95℃ 15 s和60℃ 1 min。
用配對(duì)t檢驗(yàn) mRNA 表達(dá)差異;用One-Way ANOVA 分析各與臨床病理參數(shù)間的關(guān)聯(lián)性;用 Pearson coefficient 分析各基因間的關(guān)聯(lián)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
經(jīng)t檢驗(yàn)分析,USP22mRNA在癌癥組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.0001,圖1)。
去泛素化酶是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子。這一調(diào)控過程是極為復(fù)雜的,涉及到細(xì)胞周期的多個(gè)水平。在這里,我們首先分析了USP22、BMI-1、c-Myc、p16INK4a、p14ARF和cyclin D2 在轉(zhuǎn)錄水平上的關(guān)聯(lián)性(表1)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,USP22 mRNA的表達(dá)與BMI-1 mRNA(r=0.790,P<0.0001),c-Myc mRNA(r=0.528,P<0.0001)、cyclin D2 mRNA(r=0.657,P<0.0001),但是與p16INK4a mRNA(r=0.103,P=0.358)和p14ARF mRNA(r=0.039,P=0.731)無關(guān)。
為了確定上述基因的mRNA表達(dá)特點(diǎn),我們采用k-均值聚類分析。分析結(jié)果顯示USP22、BMI-1、c-Myc和cyclin D2的表達(dá)呈聚集現(xiàn)象。按照四者的表達(dá)量可將其分為三組:高表達(dá)組16例、中表達(dá)組55例和低表達(dá)組11例。與臨床資料相對(duì)比,四者的表達(dá)與AJCC的分期進(jìn)展顯著相關(guān)(P=0.005,圖2)。
表1 82例腸癌患者mRNA轉(zhuǎn)錄水平上的關(guān)聯(lián)性分析
注:c為腫瘤組;n為對(duì)照組
越來越多的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了BMI-1致癌基因相關(guān)的PcG途徑是調(diào)節(jié)正常干細(xì)胞和癌癥干細(xì)胞的主要機(jī)制[1-3]。到目前為止,很多實(shí)驗(yàn)結(jié)果都顯示USP22和BMI-1在功能上存在很多交叉。因此,有學(xué)者提出USP22和BMI-1可能構(gòu)建一個(gè)共同體來調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展[4]。此外,USP22為c-Myc功能所需,而BMI-1與c-Myc一起參與小鼠T、B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生。這些資料提示我們USP22、BMI-1、c-Myc三者間存在密切聯(lián)系。故我們首先探討了USP22、c-Myc和BMI-1之間的關(guān)聯(lián)性。在我們的實(shí)驗(yàn)中,無論是在轉(zhuǎn)錄水平還是在蛋白水平,USP22、c-Myc和BMI-1之間均呈顯著正相關(guān)。
PI3K/Akt通路廣泛存在細(xì)胞中,是參與細(xì)胞生長、增殖、分化調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。關(guān)于PcG蛋白參與Akt通路調(diào)節(jié)的研究少有報(bào)道。Lee JY[5]等報(bào)道在乳腺癌組織中,MEL-18與AKT的活性呈負(fù)相關(guān);MEL-18的表達(dá)減弱乳腺癌細(xì)胞的增長,導(dǎo)致G1期停滯,其可能的機(jī)制為通過不依賴INK4a/ARF的方式促使Akt通路失活進(jìn)而下調(diào)cyclin D和p27 KIP1。為了確認(rèn)USP22是否能夠調(diào)控Akt通路,我們檢測并確認(rèn)了USP22、BMI-1、pAkt(Ser 473)和pAkt(Thr 308)的關(guān)聯(lián)性。我們發(fā)現(xiàn),USP22和BMI-1均與pAkt(Ser 473)和pAkt(Thr 308)呈正相關(guān),這提示我們USP22可直接或者通過BMI-1介導(dǎo)活化 Akt通路。因?yàn)镻I3K可通過Akt、mTOR將有絲分裂信號(hào)傳遞給 p70 S6K1,使細(xì)胞周期主要蛋白如細(xì)胞周期素(cyclin D)的翻譯上調(diào),促進(jìn)G1期進(jìn)展,使細(xì)胞周期加速,因此我們同時(shí)檢測并分析了cyclinD2與pAkt(Ser 473)和pAkt(Thr 308)的相關(guān)性。我們發(fā)現(xiàn),cyclin D2的表達(dá)與pAkt(Ser 473)和pAkt(Thr 308)的表達(dá)呈明顯正相關(guān)。因此,USP22調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的機(jī)制有可能是通過cyclin D2介導(dǎo)Akt通路的活性。
總之,USP22、BMI-1、c-Myc、cyclin D2無論在轉(zhuǎn)錄水平還是在蛋白水平均呈顯著相關(guān)性,并且通過k-均值聚類分析示四者表達(dá)的高低與結(jié)直腸癌的臨床分期呈正相關(guān),提示USP22、BMI-1、c-Myc、cyclin D2四者間存在調(diào)控結(jié)直腸癌進(jìn)展的機(jī)制。另外,上述四者的蛋白表達(dá)與p16INK4a和p14ARF的蛋白表達(dá)無相關(guān)性,但是均與Akt的活性呈正相關(guān),提示USP22可能是通過不依賴INK4a/ARF的方式,而通過調(diào)節(jié)Akt的活性來控制細(xì)胞周期的進(jìn)展。
[1] Park IK,Qian D,Kiel M,et al.Bmi-1 is required for maintenance of adult self-renewing haematopoietic stem cells.Nature,2003,423(6937):302-305.
[2] Lessard J,Sauvageau G.Bmi-1 determines the proliferative capacity of normal and leukaemic stem cells.Nature.,2003,423(6937):255-260.
[3] Brabletz T,Jung A,Reu S,et al.Variable beta-catenin expression in colorectal cancers indicates tumor progression driven by the tumor environment.Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(18):10356-10361.
[4] Molofsky AV,Pardal R,Iwashita T,et al.Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation.Nature,2003,425(6961):962-967.
[5] Zhang XY,Varthi M,Sykes SM,et al.The putative cancer stem cell marker USP22 is a subunit of the human SAGA complex required for activated transcription and cell-cycle progression.Mol Cell,2008,29(1):102-111.