史 輝，黃其梅，葉美娜，阮少江，陳 勇

(1.寧德師范學(xué)院生物系，福建 寧德 352100;2.閩東特色生物資源福建省高校工程研究中心，福建 寧德 352100)

愛玉ISSR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化*

史 輝1,2，黃其梅1，葉美娜1，阮少江1,2，陳 勇1,2

(1.寧德師范學(xué)院生物系，福建 寧德 352100;2.閩東特色生物資源福建省高校工程研究中心，福建 寧德 352100)

通過單因子試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)，對(duì)影響愛玉ISSR-PCR擴(kuò)增效果的因素，如模板DNA用量、Taq酶用量、dNTPs濃度、引物濃度、延伸時(shí)間和循環(huán)次數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化.實(shí)驗(yàn)確立了可用于愛玉ISSR-PCR分析最適宜的反應(yīng)體系：20 μL反應(yīng)體積中含1 ng模板DNA、1.0 U Taq酶、0.4 μmol/L引物和0.18 mmol/L dNTPs；PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸2.5 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7min，4 ℃保存.應(yīng)用該體系對(duì)14份愛玉種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，證實(shí)了該體系的適用性和穩(wěn)定性.

愛玉；ISSR；反應(yīng)體系；正交設(shè)計(jì)

愛玉(FicuspumilaL. var.awkeotsang)是桑科榕屬(Moraceae,Ficus)植物，分布于中國的福建省東北部、浙江南部和臺(tái)灣.愛玉瘦果制成的愛玉凍是一種高貴的天然食品，富含果膠、維生素和礦質(zhì)元素，且糖分與脂肪含量較低，可作為低脂低熱食品研發(fā)的重要資源，具有良好的應(yīng)用前景.近年來愛玉栽培面積不斷擴(kuò)大，對(duì)優(yōu)良品系的需求越來越多.目前，人們對(duì)愛玉遺傳背景不是很了解，為防止因偽劣品系或品系混亂造成生產(chǎn)損失，對(duì)愛玉優(yōu)良品系進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別尤為重要.

簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增(Inter-simple sequence repeats，ISSR)是在微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)上發(fā)展起來的標(biāo)記技術(shù)，具有多態(tài)性高和產(chǎn)物特異性強(qiáng)等特點(diǎn)[1]，廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、基因定位、遺傳作圖、遺傳多樣性、進(jìn)化及分子生態(tài)學(xué)研究.目前，ISSR技術(shù)已在香蕉、芒果、柑橘等多種果樹上得到廣泛應(yīng)用，但在關(guān)于愛玉的研究還未見報(bào)道.不同植物的ISSR反應(yīng)體系中各成分用量、擴(kuò)增程序和適宜引物均不同[2]，因此進(jìn)行體系優(yōu)化是研究的前提.筆者采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法，建立愛玉ISSR-PCR最適反應(yīng)體系，以期為愛玉種質(zhì)資源鑒定與引種等奠定研究基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 試材 供試材料為愛玉太6品系基因組DNA，采自福州閩侯南嶼鎮(zhèn)愛玉生態(tài)研究園.

1.1.2 試劑 Taq DNA聚合酶與DL2000 Marker均購自Takala公司，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，瓊脂糖為西班牙Biowest進(jìn)口分裝，其他試劑均為國藥分析純.

1.1.3 儀器 梯度PCR擴(kuò)增儀(美國Biometra C-412)，移液槍(法國吉爾森 Ppetman系列)，制冰機(jī)(Scotsman AF100-AS)，超純水系統(tǒng)(美國MILLI-Q)，渦旋振蕩器(德國IKAMS3digital)，電泳儀(北京六一DYY-10C型)，紫外透射儀(上海嘉鵬科技有限公司ZF)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad GelDoc EZ).

1.2方法

1.2.1 ISSR-PCR反應(yīng)體系單因子優(yōu)化 選用UBC808引物(序列為(AG)8C)，模板為愛玉太6品系DNA，分別對(duì)影響ISSR-PCR擴(kuò)增的DNA模板用量、Taq酶用量、引物濃度、dNTPs濃度、循環(huán)次數(shù)和延伸時(shí)間等6個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化.分別設(shè)置11個(gè)模板用量為0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1，2，3，4，5 ng；10個(gè)Taq酶用量為0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2 U；10個(gè)引物用量為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 μmol/L;10個(gè)dNTPs濃度為0.10，0.12，0.14，0.16，0.18，0.20，0.22，0.24，0.26，0.28 mmol/L；5個(gè)循環(huán)數(shù)為25，30，35，40，45個(gè)；5個(gè)延伸時(shí)間為1.0，1.5，2.0，2.5，3 min.初始反應(yīng)體系為：模板DNA 1 ng；808引物0.5 μmol/L；10*buffer 2 μL；dNTPs 0.20 mmol/L；Taq酶 0.5 U；補(bǔ)ddH2O至20 μL.初始PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸7 min，4 ℃保存[3].擴(kuò)增結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)并拍照記錄數(shù)據(jù).比較各因素在不同梯度時(shí)的擴(kuò)增效果，每個(gè)因素的優(yōu)化條件作為后續(xù)的擴(kuò)增條件.

1.2.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系正交優(yōu)化 根據(jù)單因子試驗(yàn)初步確定Taq酶用量、引物濃度、dNTPs濃度、循環(huán)數(shù)和延伸時(shí)間后，采用L18(35)正交設(shè)計(jì)[4]對(duì)各個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化組合(見表1).參照文獻(xiàn)[4]，以譜帶多態(tài)性高、主帶清晰、副帶明顯、背景低為原則，對(duì)正交實(shí)驗(yàn)各處理綜合評(píng)分，最高為10分，最低為1分.根據(jù)打分求出每個(gè)因素同一水平下的平均值ki，并求出極差R，得到愛玉ISSR-PCR反應(yīng)各因素的最佳組合.正交優(yōu)化試驗(yàn)因子和水平數(shù)見表1.

表1 ISSR-PCR反應(yīng)體系正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表L18(35)

1.2.3 優(yōu)化體系適用性檢測(cè) 為了驗(yàn)證優(yōu)化后體系的適用性和穩(wěn)定性，隨機(jī)選擇2個(gè)適宜引物，用此優(yōu)化的反應(yīng)體系對(duì)14份愛玉種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證其優(yōu)化效果.

2 結(jié)果與討論

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1模板用量對(duì)PCR的影響 模板用量對(duì)擴(kuò)增譜帶數(shù)量的影響不大(見圖1)，主要影響譜帶的亮度，隨著用量的增加，條帶亮度略有增加，當(dāng)模板用量超過1 ng時(shí)，條帶亮度不再增加.因此，模板量選用1 ng.

2.1.2 Taq酶用量對(duì)PCR的影響 Taq酶用量對(duì)結(jié)果影響明顯(見圖2)，當(dāng)Taq酶用量小于0.9 U時(shí)，隨著酶用量的增加，擴(kuò)增條帶亮度明顯增加.達(dá)到0.9 U時(shí)，條帶亮度最高，再增加酶的用量，條帶亮度降低，擴(kuò)增效果變差.當(dāng)達(dá)到1.2 U時(shí)，幾乎無擴(kuò)增，因此0.9 U為Taq酶最適的用量.

M—DL 2000;1—11分別表示5,4,3,2,1,0.5,0.4,0.3,0.2,0.1,0.05 ng模板DNA.

M—DL 2000;1—10分別表示0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0,1.1,1.2 U Taq酶.

2.1.3 dNTPs濃度對(duì)PCR的影響 在圖3中顯示，濃度在0.10～0.18 mmol/L范圍內(nèi)，隨濃度的增加，條帶數(shù)量不變，清晰度略有增加，當(dāng)濃度超過0.18 mmol/L時(shí)，條帶的數(shù)量和清晰度隨之下降，在大約250 bp處出現(xiàn)模糊分散的擴(kuò)增條帶，這是非特異性擴(kuò)增所致.為后續(xù)正交試驗(yàn)考慮，選中間的一個(gè)條帶較為清晰的濃度0.16 mmol/L作為適宜的dNTPs濃度.

2.1.4 引物濃度對(duì)PCR的影響 如圖4，在一定范圍內(nèi)，隨著引物濃度的增加，條帶的數(shù)量和清晰度隨之增加.當(dāng)引物濃度超過0.4 μmol/L時(shí)，條帶的清晰度隨之下降，在250 bp處出現(xiàn)模糊的非特異性條帶.所以，引物濃度選擇0.4 μmol/L.

M—DL 2000;1—10分別表示0.10,0.12,0.14,0.16,0.18,0.20,0.22,0.24,0.26,0.28 mmol/L dNTPs.

M—DL 2000;1—10分別表示0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0 μmol/L 引物.

2.1.5 延伸時(shí)間對(duì)PCR的影響 如圖5，隨著延伸時(shí)間的增加，條帶的數(shù)量、亮度和清晰度變化不大，有些大于2 000 bp的大片段雖有擴(kuò)增，但很模糊，后續(xù)條帶計(jì)數(shù)困難.為節(jié)約時(shí)間，延伸時(shí)間選2 min.

2.1.6 循環(huán)數(shù)對(duì)PCR的影響 循環(huán)數(shù)決定PCR產(chǎn)物量.循環(huán)數(shù)少，產(chǎn)量少，條帶弱；循環(huán)數(shù)過多會(huì)引入非特異性擴(kuò)增.如圖6，25個(gè)循環(huán)幾乎無擴(kuò)增，隨著循環(huán)數(shù)的增加，條帶的亮度有增加趨勢(shì)，但條帶數(shù)量明顯減少，有些大于750 bp的片段幾乎無擴(kuò)增.因此，30個(gè)循環(huán)是最適宜的延伸時(shí)間.

M—DL 2000;1—5分別表示1,1.5,2,2.5,3 min延伸時(shí)間.

M—DL 2000;1—5分別表示25,30,35,40,45循環(huán).

2.2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖7中，正交試驗(yàn)的所有處理均有擴(kuò)增條帶，但不同處理其擴(kuò)增條帶的數(shù)量、明亮度和清晰度不同.以譜帶多態(tài)性高、主帶清晰、副帶明顯、背景低為原則，對(duì)正交實(shí)驗(yàn)各處理綜合評(píng)分見表2.從各因素的K值可以看出，Taq酶為3水平(1.0 U)、引物為2水平(0.4 μmol/L)、dNTPs為3水平(0.18 mmol/L)、循環(huán)次數(shù)為1水平(30次)、延伸時(shí)間為3水平(2.5 min)時(shí)擴(kuò)增效果最好；從極差可以看出，循環(huán)次數(shù)對(duì)擴(kuò)增效果影響最大，30個(gè)循環(huán)明顯優(yōu)于其他循環(huán)；延伸時(shí)間對(duì)擴(kuò)增效果有一定影響；Taq酶用量對(duì)擴(kuò)增效果影響最小.

表2 ISSR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)結(jié)果L18(35)

續(xù)表

M—DL 2000;1—18為處理編號(hào).

2.3優(yōu)化體系適用性檢測(cè)結(jié)果

隨機(jī)選取UBC809和UBC864這2個(gè)引物，確定最佳退火溫度Tm后，采用該優(yōu)化體系對(duì)14份愛玉種質(zhì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，都能擴(kuò)增出比較清晰的條帶，且多態(tài)性較高(見圖8)，說明該優(yōu)化后的反應(yīng)體系適于愛玉的ISSR-PCR擴(kuò)增.

3 結(jié)論與分析

研究表明，ISSR標(biāo)記是隨機(jī)標(biāo)記，影響ISSR-PCR的因素很多，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序中的每個(gè)因子都對(duì)最終的擴(kuò)增效果有影響[5].但在各種擴(kuò)增參數(shù)固定的條件下，會(huì)表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性[6].因此，對(duì)ISSR-PCR反應(yīng)體系的各種影響因子如模板用量、Taq酶用量、dNTPs、引物濃度、Mg2+離子等因素進(jìn)行優(yōu)化和篩選是必要的，也是應(yīng)用該技術(shù)的前提[7].

(1) 模板用量關(guān)系到PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量和特異性.當(dāng)模板用量過低時(shí)，引物與模板結(jié)合的幾率小，擴(kuò)增效率低，條帶淺或無條帶；當(dāng)模板用量過高時(shí)，非特異性條帶增加，同時(shí)也會(huì)增加模板之間配對(duì)的機(jī)會(huì)，減少引物與模板的配對(duì)，也可能將雜質(zhì)過多地帶入反應(yīng)體系[8-9].其他植物的研究發(fā)現(xiàn)，ISSR-PCR反應(yīng)對(duì)模板DNA用量范圍要求較寬，20 μL反應(yīng)體系中一般為5～50 ng[10-11].但筆者在前期的研究中，模板量超過20 ng就幾乎沒有擴(kuò)增.可能是因?yàn)閻塾窕蚪M較小，少量的基因組DNA含有與其他植物等量的模板；也可能是因?yàn)閻塾袢~片多酚、多糖類次生物質(zhì)含量極高[12]，模板DNA純度較低.因?yàn)槟０錎NA中的雜質(zhì)會(huì)抑制Taq酶活性，適當(dāng)稀釋會(huì)減少雜質(zhì)對(duì)Taq酶活性的抑制[13].研究中適宜的模板DNA用量為1 ng.

(2) 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，Taq酶用量對(duì)擴(kuò)增效果影響很大.當(dāng)Taq酶用量過低時(shí)，催化能力弱，產(chǎn)物的合成量低，條帶淺；當(dāng)Taq酶用量過高時(shí)，不僅增加試驗(yàn)成本，而且產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，背景增強(qiáng)，條帶模糊，甚至無擴(kuò)增.

(3) dNTPs濃度太高容易產(chǎn)生錯(cuò)配，增加非特異性擴(kuò)增；濃度太低擴(kuò)增效率低，甚至?xí)驗(yàn)閐NTPs的過早消耗完畢，而使擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈化，影響擴(kuò)增效果[14].文中dNTPs的濃度小于0.10 mmol/L 時(shí)擴(kuò)增條帶較弱，當(dāng)濃度大于0.20 mmol/L時(shí)又出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，且部分特異性擴(kuò)增條帶丟失.

(4) 當(dāng)引物濃度過高時(shí)，易引入堿基錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，還會(huì)形成引物二聚體；當(dāng)引物濃度過低時(shí)，與模板結(jié)合效率低，產(chǎn)量下降，并有可能出現(xiàn)涂抹現(xiàn)象[15].文中引物濃度對(duì)結(jié)果影響較為明顯，濃度太低不能進(jìn)行有效的擴(kuò)增，濃度太高會(huì)條帶不穩(wěn)定及清晰度下降.這與其他植物研究結(jié)果較為一致.

(5) 延伸時(shí)間過短，產(chǎn)物得不到有效擴(kuò)增；延伸時(shí)間過長(zhǎng)，易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增.研究中選用的幾個(gè)延伸時(shí)間梯度都比較長(zhǎng)，基本都能滿足擴(kuò)增的需要，延長(zhǎng)延伸時(shí)間對(duì)長(zhǎng)片段的擴(kuò)增有利，但是在該研究中幾個(gè)長(zhǎng)片段的擴(kuò)增效果不明顯，對(duì)結(jié)果幾乎無影響.

(6) 循環(huán)數(shù)對(duì)結(jié)果影響較顯著，循環(huán)數(shù)不足，幾乎沒有擴(kuò)增；循環(huán)數(shù)過多，又會(huì)丟失大部分特異性擴(kuò)增的大片段.可能是過多的循環(huán)數(shù)使Taq酶活性減弱，擴(kuò)增速度減慢，在一定的延伸時(shí)間內(nèi)，只能完成中小片的擴(kuò)增，不能完成較大片段的擴(kuò)增.

考慮ISSR-PCR主要反應(yīng)參數(shù)間的交互作用[16]，在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步作正交試驗(yàn).考慮到愛玉模板濃度對(duì)結(jié)果影響最小，模板濃度范圍較寬，為減少工作量，正交試驗(yàn)中就不再對(duì)模板濃度進(jìn)行優(yōu)化.正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是從多個(gè)因子中挑選出有代表性的水平組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，相對(duì)于多因子的完全組合設(shè)計(jì)大大減少了工作量，以最少的處理組合，獲得最優(yōu)體系[17].由于文中對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)分主要依靠主觀判斷，存在一定的主觀性，因此需要檢測(cè)優(yōu)化體系的適用性和穩(wěn)定性.

該實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的ISSR反應(yīng)體系在14份愛玉材料中都能擴(kuò)增出穩(wěn)定清晰，多態(tài)性高的條帶.因此，建立的愛玉ISSR-PCR 反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠，適用于其他ISSR引物和所有愛玉種質(zhì)，可以為后續(xù)應(yīng)用ISSR標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行愛玉種質(zhì)遺傳多樣性分析、品種鑒定和引種等工作奠定研究基礎(chǔ).

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(責(zé)任編輯 易必武)

EstablishmentandOptimizationofISSRReactionSystemforFicusPumilaL.var.Awkeotsang

SHI Hui1,2,HUANG Qimei1,YE Meina1,RUAN Shaojiang1,2,CHEN Yong1,2

(1.Department of Biology,Ningde Normal University,Ningde Fujian 352100,China;2.Fujian Provinces University Project Research Center of Biological Resources with Mingdong’s Unique Feature,Ningde 352100,Fujiang China)

The factors affecting the ISSR-PCR amplification onFicuspumilaL. var.awkeotsangsuch as dosage of template DNA,Taq DNA polymerase,dNTPs,primers and extension time and cycle times were optimized through the combination of single factor and orthogonal design experiment.The results showed that the optimal reaction system for ISSR-PCR of Ficus pumila were as follows:In the 20 μL reaction volume,1ng template DNA,1.0U Taq DNA polymerase,0.4 μmol/L primers,0.18 mmol/L dNTPs.The optimal PCR amplification process was:4 minutes at 94 ℃ for predenaturation,then followed by 35 cycles,each with 45 seconds at 94 ℃ for denaturation,45 seconds at 53 ℃ for annealing,2 at 72 ℃ for extension,finally extension at 72 ℃ for 7 minutes and holding the samples at 4 ℃.The system was applied in the amplification of 14 varieties of indicated the suitability and stability of the system.

FicuspumilaL. var.awkeotsang;inter-simple sequence repeat(ISSR);reaction system;orthogonal design

1007-2985(2014)02-0073-06

2013-12-26

寧德師范學(xué)院“服務(wù)海西建設(shè)”資助項(xiàng)目(2010H309)；福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2006JA0399)；福建省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目(201310398019)

史 輝(1979-)，男，安徽淮北人，寧德師范學(xué)院生物系副教授，碩士，主要從事作物遺傳育種教學(xué)研究

陳 勇(1954-)，男，江蘇南京人，寧德師范學(xué)院生物系教授，主要從事植物分類教學(xué)研究

S667

A

10.3969/j.issn.1007-2985.2014.02.017