陳廣理，龔樹(shù)生，陳 沛，羅凌惠

Axl基因在喉癌細(xì)胞Hep-2中的表達(dá)及意義

陳廣理1，龔樹(shù)生2，陳 沛3，羅凌惠3

目的研究Axl 基因在喉癌細(xì)胞Hep-2中的表達(dá)，探討Axl 基因與喉癌細(xì)胞的增值、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法提取Hep-2和人永生化表皮細(xì)胞Hacat細(xì)胞RNA，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)Axl mRNA的表達(dá)；應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)Axl蛋白質(zhì)在細(xì)胞Hep-2和Hacat中的表達(dá)。結(jié)果Axl mRNA在Hep-2細(xì)胞中高表達(dá)，平均相對(duì)積分吸光密度值為：0.8601±0.0409；Axl mRNA在Hacat細(xì)胞中低表達(dá)，平均相對(duì)積分吸光密度值為：0.2637±0.0503，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.682,P<0.01)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色表明Axl在Hep-2細(xì)胞中高表達(dá)，平均吸光密度值為：0.2621±0.0238；在Hacat細(xì)胞中低表達(dá)，平均吸光密度為：0.0729±0.0201，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=25.938，P<0.01)。結(jié)論Axl與喉癌細(xì)胞Hep-2的增值、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。

Axl 基因；Hep-2；Hacat；RT-PCR

Axl (Anexelekto) 屬于酪氨酸激酶家族，在多種腫瘤組織中過(guò)度表達(dá)，并與腫瘤細(xì)胞增殖、惡性程度、轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)。Axl抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷徙及存活，參與腫瘤性血管生成，Axl與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[1]。喉癌具有浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力，本實(shí)驗(yàn)研究Axl在喉癌細(xì)胞Hep-2中的表達(dá)，探討Axl與喉癌細(xì)胞的增生、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclon)，胎牛血清(Sigma)，TRIzol試劑(Gibco),逆轉(zhuǎn)錄酶MLV(MBI)，TaqDNA聚合酶(MBI)，dNTP(MBI)，Axl單克隆抗體為小鼠IgG (Zymed)，二抗體(Zymed)，PTC200 PCR儀(MJ Research)，DU650型紫外光分光光度儀(BECKMAN)，GDS8000型凝膠成像系統(tǒng)(UVP)，Grab-it 4.0分析軟件為Gelworks 1D interdiate。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人喉癌細(xì)胞Hep-2和正常永生化表皮細(xì)胞Hacat用含10%的胎牛血清和RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)箱內(nèi)條件為37℃，5%CO2。2 d傳代1次。

1.3引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 引物序列表

1.4細(xì)胞RNA提取將長(zhǎng)滿約90%細(xì)胞(約5×106的細(xì)胞)的100 mm培養(yǎng)瓶置于冰上，吸去培養(yǎng)液，直接加入1 mL TRIZOL試劑，反復(fù)吹打。然后按說(shuō)明用氯仿和異丙醇逐步提取RNA，溶于焦碳酸二乙脂水中，用紫外分光光度儀檢測(cè)定量。

1.5PCR擴(kuò)增cDNA合成按MBI公司的合成cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑說(shuō)明進(jìn)行。以cDNA為模板，擴(kuò)增β-actin (300 bp)及Axl (202 bp)等基因片斷。PCR反應(yīng)Axl和β-actin引物在同一EP管中進(jìn)行。反應(yīng)體系(25 μL)中含cDNA 2.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，Mg2+2.0 mmol，dNTP 0.2 mmol，上游和下游引物各0.2 μmol，TaqDNA聚合酶1 U。Axl的反應(yīng)條件為：95℃ 5 min，95℃ 1 min、50℃ 1 min、72℃ 1 min，共34循環(huán)然后72℃延伸5 min。取5 μL產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并用grab-It系統(tǒng)成像，然后分析各條帶的積分吸光密度值，以目的基因?qū)Ζ?actin的相對(duì)積分吸光密度值記錄結(jié)果。

1.6免疫細(xì)胞化學(xué)染色在培養(yǎng)板內(nèi)爬滿各20張蓋玻片的Hep-2和Hacat細(xì)胞，用丙酮固定(丙酮：無(wú)水乙醇=1∶1)10～15 min。采用SP法作perlecan免疫細(xì)胞化學(xué)染色。抗Axl單克隆抗體1∶100稀釋，DAB顯色液顯色，呈棕黃色著色，以正常小鼠血清代替一抗體為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察：每張玻片分別在Olympus雙目顯微鏡下放大200倍，隨機(jī)選取5個(gè)視野通過(guò)HAPIAS-1000型全自動(dòng)圖像分析儀，分析各張玻片的Axl的平均吸光密度值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 17.0軟件，用兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)分析Axl mRNA和蛋白質(zhì)在Hep-2細(xì)胞與在Hacat細(xì)胞表達(dá)差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1AxlmRNA在Hep-2和Hacat細(xì)胞中的表達(dá)在Hep-2細(xì)胞中Axl mRNA (202 bp)高表達(dá)，平均相對(duì)積分吸光密度值為：0.8601±0.0409；Axl mRNA在Hacat細(xì)胞中低表達(dá)，平均相對(duì)積分吸光密度值為：0.2637±0.0503(圖1)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.682，P<0.01)。

泳道 M：Marker；泳道 1 ：Axl mRNA在Hep-2細(xì)胞中的PCR產(chǎn)物(202 bp)，β-actin (300 bp)；泳道 2：Axl mRNA在Hacat細(xì)胞中的PCR產(chǎn)物(202 bp)，β-actin (300 bp)。

圖1AxlmRNA在Hep-2和Hacat細(xì)胞中的表達(dá)

2.3Axl免疫細(xì)胞化學(xué)染色改變Axl在Hep-2細(xì)胞中高表達(dá)，分布于細(xì)胞的胞漿和部分胞核(圖2)，平均吸光密度值為：0.2621±0.0238；Axl在Hacat細(xì)胞的胞漿和胞核弱表達(dá)或不表達(dá)(圖3)，平均吸光密度為: 0.0729±0.0201；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=25.938，P<0.01)。

圖2 Axl在Hep-2細(xì)胞中高表達(dá)，分布于細(xì)胞胞漿和部分胞核(SP，×400)

圖3 Axl在Hacat細(xì)胞低表達(dá)(SP，×400)

3 討論

喉癌發(fā)病率占全身惡性腫瘤的5.7%～7.6%，在耳鼻喉科領(lǐng)域中僅次于鼻咽癌和鼻腔、鼻竇癌，居第3位，好發(fā)年齡為50～70歲。我國(guó)以東北地區(qū)發(fā)病率最高，男性居多，其病因尚不十分清楚。Axl屬于酪氨酸激酶家族，Axl的配體是由生長(zhǎng)停滯特異性基因6(Growth arrest specific gene 6)所編碼的蛋白分子Gas6。因Axl其特殊的結(jié)構(gòu),既有黏附分子的特點(diǎn)，又具有酪氨酸激酶活性。研究發(fā)現(xiàn)Axl/Gas6活化系統(tǒng)在細(xì)胞的黏附與識(shí)別、增殖、抗凋亡中有重要作用。Axl在多種腫瘤組織中高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞增值、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]。

本實(shí)驗(yàn)表明，Axl在喉癌細(xì)胞中高表達(dá)，在正常細(xì)胞中低表達(dá)，喉癌細(xì)胞的快速生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移可能與Axl的高表達(dá)有密切的關(guān)系。主要發(fā)生機(jī)制討論如下。

3.1Axl抑制腫瘤細(xì)胞凋亡Axl與Gas6結(jié)合所引發(fā)的信號(hào)通路能夠抑制細(xì)胞凋亡,并具有使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的能力。在正常情況下，Axl沒(méi)有分裂原活性，當(dāng)Axl過(guò)度表達(dá)時(shí),Axl的分裂原活性就會(huì)表現(xiàn)出來(lái)，使細(xì)胞過(guò)度增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤形成。Sawabu等[2]研究表明，在胃癌中Axl和Gas6高表達(dá)，并且啟動(dòng)了下游磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶信號(hào)通路，抑制胃癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胃癌細(xì)胞過(guò)度增殖。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Axl在喉癌Hep-2細(xì)胞中高表達(dá)，可能是Axl抑制喉癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)了喉癌細(xì)胞的增殖。

3.2Axl促進(jìn)腫瘤新生血管形成的作用腫瘤新生血管生成是腫瘤生長(zhǎng)的前提,其與多種生長(zhǎng)因子有關(guān),其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF是促進(jìn)作用最強(qiáng)的因子之一。Holland 等[3]研究表明，Axl調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷徙及存活，參與腫瘤性血管生成,并且 Axl在腫瘤中高表達(dá)，與VEGF協(xié)同促進(jìn)腫瘤新生血管的生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Axl在喉癌細(xì)胞中高表達(dá)，可能與Axl與VEGF共同促進(jìn)喉癌的新生血管生成有關(guān)。

3.3Axl促進(jìn)腫瘤的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移侵襲與轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤本質(zhì)特征，與細(xì)胞黏附分子表達(dá)的改變及基質(zhì)的降解密切相關(guān)。在多種癌細(xì)胞中受體酪氨酸激酶Axl都過(guò)度表達(dá)，Axl在腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲過(guò)程中發(fā)揮作用。TaiK等[4]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)癌細(xì)胞大量表達(dá)Axl時(shí)，會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的表達(dá),加速分解基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。Mishra等[5]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3和DU145L中Axl高表達(dá)，低轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞系LNCaP中Axl是較低表達(dá)，表明Axl在前列腺癌轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。Lee等[6]研究中Axl表達(dá)可促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病和進(jìn)展。Axl表達(dá)是鱗狀細(xì)胞癌侵襲性和臨床轉(zhuǎn)歸的一個(gè)有價(jià)值的標(biāo)志物。臨床上喉癌是具有極高浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力的腫瘤，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Axl在喉癌細(xì)胞中高表達(dá)，提示Axl可能促進(jìn)了喉癌細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。

總之，本文通過(guò)檢測(cè)Axl在喉癌細(xì)胞中的高表達(dá)，提示了Axl與喉癌的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移可能有密切關(guān)系。Axl表達(dá)是喉癌侵襲性和臨床轉(zhuǎn)歸有價(jià)值的標(biāo)志物之一。由于受體酪氨酸激酶Axl過(guò)表達(dá)與多種疾病有關(guān)，因此Axl可成為診斷腫瘤的指標(biāo)之一，是治療腫瘤的重要靶分子。通過(guò)抑制或阻斷Axl在腫瘤組織中的表達(dá)在抗腫瘤的治療中可能有重要的價(jià)值。

[1]Hutterer M,Knyazev P,Abate A,et al.Axl and growth arrest specific gene 6 are frequently overexpressed in human gliomas and predict poor prognosis in patients with glioblastoma multiforme[J].Clin Cancer Res,2008,14(1):130-138.

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[3]Holland SJ,Powell MJ,Franci C,et al.Multiple roles for the receptor tyrosine kinase axl in tumor formation[J].Cancer Res,2005,65(20): 9294-9303．

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[6]Lee CH,Yen CY,Liu SY,et al.Axl is a prognostic marker in oral squamous cell carcinoma[J].Ann Surg Oncol,2012,19(Suppl 3):500-508.

ExpressionofAxlinLaryngealCarcinomaCellHep-2anditsSignificance

CHEN Guang-li,GONG Shu-sheng,CHEN Pei,et al

(Third Affiliated Hospital,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

ObjectiveTo study the expression of Anexelekto (Axl) in human laryngeal carcinoma cells and its significance.MethodsIn this study,we investigated the expression of Axl mRNA in human laryngeal carcinoma cells,Hep-2 cells,using techniques of RT-PCR,and investigated the expression of Axl in the Hep-2 cells using techniques of immunohistochemistry.ResultsIt showed that the expression level of Axl and Axl mRNA significantly increased in Hep-2 cells as compared with the normal cells,Hacat cells (P<0.01).ConclusionThese data raise the possibility that Axl many play key roles in the growth,invasion and metastasis of human laryngeal carcinoma.

Axl；Hep-2；Hacat；RT-PCR

2014-05-31

1.洛陽(yáng)東方醫(yī)院耳鼻咽喉科，河南洛陽(yáng) 471003 2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，北京 100730 3.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院耳鼻咽喉科，湖北武漢 430022

陳廣理(1971-)，男，河南鄢陵人，副主任醫(yī)師，從事耳鼻咽喉科基礎(chǔ)與臨床工作。

R739.65

A

1672-688X(2014)03-0170-03