青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810016

藏藥余甘子對(duì)大鼠CYP2C9活性的影響

段雅彬姚星辰李向陽(yáng)*

青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810016

目的分析藏藥余甘子對(duì)CYP2C9酶活性的影響。方法對(duì)照組灌胃給予生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組灌胃給予余甘子。采用探針?biāo)幬锓ㄔu(píng)價(jià)CYP2C9的活性，探針?biāo)幬镆约按x產(chǎn)物的濃度用HPLC測(cè)定。結(jié)果對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組大鼠CYP2C9活性分別為0.083±0.042和0.100±0.049 ，兩組數(shù)據(jù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論余甘子對(duì)大鼠CYP2C9的活性無(wú)影響。

藏藥；余甘子；CYP2C9

余甘子為大戟科葉下珠屬植物，在《藏藥標(biāo)準(zhǔn)》所載的290種藏藥成藥中，含余甘子的有 72 種，占總數(shù)的25%。余甘子有防癌作用、抗誘變、抗致畸、抗炎、抗氧化、抗衰老、保肝、 抗?jié)儭⒚庖哒{(diào)節(jié)作用[1]。并且有清熱涼血，消食健胃，生津止咳的功效[2]。CYP2C9是P450酶系第二亞家族中的一個(gè)重要成員，占肝微粒體P450蛋白總量的20%，約有16%的臨床藥物由CYP2C9負(fù)責(zé)代謝，如苯妥因，格列苯脲，雙氯芬酸，氯沙坦等。但余甘子對(duì)其他復(fù)方制劑影響的研究尚未見(jiàn)報(bào)道，本文以CYP2C9為研究對(duì)象，用探針?biāo)幬颷3-5]來(lái)分析藏藥余甘子對(duì)該酶活性影響，為藏藥余甘子臨床用藥和配伍機(jī)制提供一定的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀(日本島津)；N2000型色譜工作站(浙江大學(xué)智能信息工程研究所)；XW-80A旋渦混合器(上海精科有限公司)；TGL-16B高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；各種常規(guī)儀器等。

1.1.2 藥品與試劑 余甘子(西寧中藏藥材批發(fā)市場(chǎng)購(gòu)買，經(jīng)青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院魏全嘉教授鑒定)；苯妥英鈉(東京化成工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)：GF01-FD)；4′-羥化苯妥英(Sigma公司，批號(hào)：00213DG)；烏拉坦(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：T20090811)；甲醇、乙腈為色譜純；水為純凈水；其余試劑均為分析純

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠20只，清潔級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20)g，由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)為14-006。飼養(yǎng)溫度(23±2)℃，照射時(shí)間12 h/d(7：00～19:00)，飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將大鼠分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組共2組，每組10只，雌雄各半。對(duì)照組灌胃給予生理鹽水(5 ml/kg)，連續(xù)3天。實(shí)驗(yàn)組灌胃給予余甘子提取液(5 ml/kg)，連續(xù)3天。第4天對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組灌胃給予探針?biāo)幬锉酵子⑩c(15 mg/kg)。

1.2.2 余甘子提取液的制備 取干燥余甘子并精密稱取100 g，加入水 1 000 ml浸泡30 min，加熱至沸騰，回流50 min，過(guò)濾，蒸發(fā)濃縮，使其質(zhì)量為0.4 g/ml。

1.2.3 對(duì)照品溶液配制 精密稱取4′-羥基苯妥英5 mg，置5 ml 量瓶中，加入純凈水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得4′-羥基苯妥英貯備液(1 mg·ml-1) 。取此液0.5 ml置5 ml 量瓶中，加入純凈水定容，即得100 μg·ml-14′-羥基苯妥英水溶液；依次稀釋成10、1 μg·ml-1的溶液。按相同方法配制得100、10、1 μg·ml-1的苯妥英鈉水溶液。

1.2.4 樣本采集 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組給予苯妥英鈉12小時(shí)后采集血液，分離血清，冰箱冷凍保存待測(cè)。

1.2.5 血漿樣品處理 從冰箱中取出樣品在室溫下解凍，渦旋30秒，吸取120μl血清樣品加40μl 30%HCLO混旋1 min，TGL-16B高速離心機(jī) 16 000 r/min離心10 min，取上清液10(l采用高效液相色譜進(jìn)樣分析。

1.2.6 酶活性評(píng)價(jià) 大鼠給予苯妥英鈉后測(cè)定12 h血清中苯妥英鈉(PHT)和代謝產(chǎn)物4′-羥基苯妥英(HPPH)，以HPPH/PHT的濃度比值評(píng)價(jià)CYP2C9的活性。

1.2.7 色譜條件 采用反相高校液相色譜法測(cè)定血清中苯妥英鈉和代謝產(chǎn)物的濃度。色譜條件 PHT和HPPH：流動(dòng)相為乙腈-水-冰乙酸-三乙胺 (40∶60∶0.3∶0.3, v/v)，色譜柱為L(zhǎng)ichrospher C18(250 mm×4.6 mm，5(m)，流速為1.0 ml·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；進(jìn)樣量10μl。在此條件下將一定濃度的苯妥英鈉和4′-羥基苯妥英的對(duì)照品溶液進(jìn)樣10μl，得對(duì)照品溶液色譜圖(Figure 1 A)；取大鼠空白血清，按樣品處理項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣10μl，得空白血清色譜圖(見(jiàn)Figure 1 B)；將一定濃度的苯妥英鈉和4′-羥基苯妥英的對(duì)照品溶液加入空白血清中，依同法操作，得相應(yīng)色譜圖(Figure 1 C)；取給藥12 h后的血清樣品，依同法操作，得給藥后的色譜圖(Figure 1 D)；其中苯妥英鈉和4′-羥基苯妥英的峰形良好，基線平穩(wěn)；結(jié)果表明，血清中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾苯妥英鈉和4′-羥基苯妥英的測(cè)定。

1.2.8 回收率及精密度 配制低、中、高濃度的標(biāo)準(zhǔn)血清樣品 (苯妥英鈉和4′-羥基苯妥英均為1、6、20 μg/ml)按“樣品預(yù)處理”項(xiàng)下操作并進(jìn)樣分析，測(cè)定值與相同濃度對(duì)照品溶液測(cè)定值相比計(jì)算回收率(n=5)；同日和連續(xù)5 日各處理5 份樣品, 求日內(nèi)RSD和日間RSD。精密度與回收率結(jié)果分別見(jiàn)表1。

表1 精密度及回收率考察結(jié)果(n=5)

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)以mean±SD表示，SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理,采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

采用前述建立的HPLC法測(cè)定對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組給藥后的CYP2C9酶活性，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組給藥后的CYP2C9酶活性評(píng)價(jià)。由表2可知，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠CYP2C9的活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，余甘子對(duì)CYP2C9的活性無(wú)影響。

表2 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組CYP2C9酶活性

3 討論

基于P450的中藥配伍機(jī)制研究文獻(xiàn)報(bào)道較多，劉琳娜[6]等驗(yàn)證了甘草水煎液對(duì)P450活性有一定增強(qiáng)作用；呼自順[7]等研究表明黃芩對(duì)CYP2C9的活性有增強(qiáng)作用，說(shuō)明黃芩對(duì)其他藥物的代謝起到減毒防毒的作用。本文研究顯示余甘子雖對(duì)CYP2C9活性無(wú)影響，但對(duì)其它P450各亞酶活性影響如何，哪類主要成分影響酶活性，當(dāng)余甘子和酶誘導(dǎo)劑或酶抑制劑合用時(shí)又會(huì)產(chǎn)生何種結(jié)果，值得進(jìn)一步研究。

葉亞琳[8]等通過(guò)采用CO還原差示光譜法測(cè)定CYP450的含量來(lái)說(shuō)明對(duì)酶活性的影響，只能驗(yàn)證P450的活性，而探針?biāo)幬锓?苯妥英鈉)可以特異性評(píng)價(jià)CYP2C9活性，李芹[9]等采用基因法研究P450酶活性，本研究采用探針?biāo)幬锓ㄔu(píng)價(jià)酶活性，并且比基因法要簡(jiǎn)便，快捷。本實(shí)驗(yàn)采用了Liehrospher C18色譜柱和乙腈-水-冰乙酸-三乙胺(40∶60∶0.3∶0.3，v/v)為流動(dòng)相，進(jìn)行等度洗脫，苯妥英鈉和4′-羥基苯妥英可以在10 min中內(nèi)完成測(cè)定，比文獻(xiàn)報(bào)道[10]的分析時(shí)間明顯縮短。

[1]侯開(kāi)衛(wèi).余甘子化學(xué)成分及其在民族民間傳統(tǒng)醫(yī)藥中的應(yīng)用[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥雜志，2002，11(6)：345.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：142.

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TheeffectofTibetanmedicinephyllanthusemblicaontheactivityofCYP2C9

Duan Ya-bin YAO Xing-chen LI Xiang-yang

Medical College of Qinghai university,Xining 810016,China

ObjectiveTo analysis the effect of Tibetan medicine Phyllanthus emblica on the activity of CYP2C9.MethodsRats in control and experimental group were administrated orally saline and Phyllanthus emblica,respectively.The activity of CYP2C9 was evaluated by the probe drugs method,And probe drugs and metabolites concentration determined by HPLC.ResultsThe rats CYP2C9 activity in control group and experimental group were 0.083±0.042 and 0.100±0.049,respectively.There was no significant difference between two groups.Conclusionthe Phyllanthus emblica had no significant effect on the activity of CYP2C9 in rats.

Tibetan medicine；Phyllanthus emblica L；CYP2C9

青海省自然科學(xué)基金(2014-Z-909)。

段雅彬(1990-)，男，在讀碩士研究生。

李向陽(yáng)，Email：qhmclxy@163．com

R29

A

1007-8517(2014)11-0008-03

2014.04.03)