1.廣東省微生物研究所，省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070；2.大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南 大理 671003

6株大型真菌發(fā)酵提取物的抑菌及細(xì)胞毒活性研究

陳玉嬋1呂華明2譚國(guó)慧1李浩華1李賽妮1章衛(wèi)民1

1.廣東省微生物研究所，省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510070；2.大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南 大理 671003

目的對(duì)6株廣東大型真菌紅汁乳菇(Lactarius hatsudake)G027、鳥巢菌(Cyathus sp.)G026、革耳菌(Panus sp.)G028、光亮小紅孔菌(Pycnoporellus fulgens)G033、菌核斗菇(Lentinus tuber-regium)G025和有柄靈芝(Ganoderma gibbosum)G036的發(fā)酵提取物進(jìn)行抑菌和細(xì)胞毒活性研究。方法分別采用濾紙片擴(kuò)散法和SRB法對(duì)這6株大型真菌的發(fā)酵提取物進(jìn)行抑菌和細(xì)胞毒活性研究。結(jié)果菌株G027、G028、G026和G033對(duì)金黃色葡萄球菌具有顯著的抑菌活性，其抑菌圈直徑分別為25.00、18.23、14.96和14.30 mm；6株大型真菌對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF-268、乳腺癌細(xì)胞MCF-7、大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460和人肝癌細(xì)胞HepG-2均有不同程度的抑制作用，其中菌株G027的活性最為顯著，對(duì)這4種腫瘤細(xì)胞株的IC50值分別為2.84、6.44、11.88和2.96 μg/mL。結(jié)論6株大型真菌具有抑菌和(或)細(xì)胞毒活性，值得進(jìn)一步深入研究。

大型真菌；發(fā)酵；提取物；抑菌；細(xì)胞毒

大型真菌是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥中的重要組成部分，真菌入藥在我國(guó)已有2000多年的歷史，史上第一部藥物名著《神農(nóng)本草經(jīng)》記載了茯苓、靈芝、豬苓、雷丸等10多種真菌[1]。大型真菌屬于“創(chuàng)造系數(shù)”特別高的生物，含有大量結(jié)構(gòu)多樣的次生代謝產(chǎn)物[2]，其代謝產(chǎn)物具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、增強(qiáng)免疫活性、降血壓、降膽固醇等多種活性，已成為新藥開發(fā)的重要天然資源，得到世界各國(guó)的重視。廣東地處于熱帶亞熱帶地區(qū)，野生大型真菌資源十分豐富，據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，廣東省已知的大型真菌有1185種，隸屬于4綱20目56科240屬，占中國(guó)野生大型真菌的30%左右[3,4]，但已研究的大型真菌資源極少，大量的大型真菌資源還有待研究和開發(fā)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅廣東南嶺自然保護(hù)區(qū)中就有55種具有抗腫瘤作用的大型真菌，占已知種類的16.6%[5]；粵北地區(qū)至少有75種抗腫瘤大型真菌，占已知種類的11.9%[6]。為了發(fā)掘具有藥用功能的野生大型真菌資源，作者在前期對(duì)廣東大型真菌活性菌株的篩選基礎(chǔ)上，采用濾紙片擴(kuò)散法和SRB法對(duì)6株大型真菌的發(fā)酵提取物進(jìn)行抑菌和細(xì)胞毒活性研究，為進(jìn)一步開發(fā)利用大型真菌資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 6株大型真菌菌株是由野外采集的新鮮子實(shí)體經(jīng)組織分離法分離純化后獲得。通過對(duì)菌株的ITS序列測(cè)定取得基因登錄號(hào)，并通過Blast程序在GenBank上進(jìn)行相似性序列檢索分析，確定分離菌株的種類(表1)。以上供試菌株均保存于廣東省微生物研究所。

1.1.2 供試腫瘤細(xì)胞株及指示菌株 供試腫瘤細(xì)胞株：神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞SF-268、乳腺癌細(xì)胞MCF-7、大細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H460、人肝癌細(xì)胞HepG-2；指示菌株：金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)。以上所有腫瘤細(xì)胞株和指示菌株均保存于廣東省微生物研究所。

表1 6株大型真菌的種名及其基因登錄號(hào)

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g， KH2PO43 g， MgSO41.5 g，維生素B 10 mg，蒸餾水1 L，pH值自然。LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 L，pH7.0。RMPI 1640完全培養(yǎng)基：RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基1 L，胎牛血清0.1 L，雙抗(10000 U/mL青霉素和10000 U/mL鏈霉素)0.01 L，混勻，4℃保存。

1.1.4 藥品與試劑 RMPI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗(10000U/mL青霉素+10000U/mL鏈霉素)均購(gòu)自Gibco公司；磺酰羅丹明B(SRB)、二甲基亞砜(DMSO)、氨芐青霉素(Ampicillin，Ap)、卡那霉素(Kanamycin Monosulfate，Km)均購(gòu)自Sigma公司；順鉑(Cisplatin)，齊魯制藥有限公司；其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.5 主要儀器 2123-2二氧化碳培養(yǎng)箱，Shellab；DMI3000B倒置顯微鏡，Leica；MULTISKAN GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，Thermo；RE-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；LRH-250生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；THZ-C-1恒溫培養(yǎng)振蕩器，廣州市正一科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的液體發(fā)酵及其提取物的制備 取4℃保存的菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基上活化，挑取活化后的適量菌絲塊接種于含250 mL馬鈴薯葡萄糖(PD)液體培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，27℃，120 r/min搖床培養(yǎng)7 d。發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過濾后收集發(fā)酵液，發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，于40℃減壓濃縮至干，得到發(fā)酵液乙酸乙酯提取物，提取物再用DMSO配成濃度為50 mg/mL的待測(cè)樣品。

1.2.2 抑菌活性的測(cè)定 采用濾紙片擴(kuò)散法[7]測(cè)定待測(cè)樣品的抑菌活性。將活化的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌用LB液體培養(yǎng)基配制成1×106～1×107cfu/ml的菌懸液，取200 uL制備好的菌懸液放入平板中，倒入溫度為40～50℃的LB培養(yǎng)基，混勻，冷卻，制成含菌平板。用無菌鑷子夾取直徑為6 mm的無菌濾紙片置于含菌平板上，每個(gè)平板放置3片，分別向每片濾紙片滴入5μL50mg/mL的樣品，以5μLDMSO作空白對(duì)照，大腸桿菌以濃度為5μL200μg /mL 的硫酸卡那霉素作陽性對(duì)照，金黃色葡萄球菌以5μL 200 μg /mL 氨芐青霉素作陽性對(duì)照，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，37℃培養(yǎng)24 h后，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況和抑菌圈的大小，用十字測(cè)量法測(cè)量抑菌圈的直徑，計(jì)算抑菌圈的直徑(含濾紙片直徑)。

1.2.3 細(xì)胞毒活性的測(cè)定 采用SRB[8]法測(cè)定樣品對(duì)腫瘤細(xì)胞株生長(zhǎng)的抑制活性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SF-268、MCF-7、NCI-H460、HepG-2細(xì)胞，用胰酶消化，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力大于95%后，用RMPI 1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104個(gè)/mL，細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入180μL的細(xì)胞懸液，并設(shè)3個(gè)空白孔調(diào)零，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞貼壁后，每孔加入20μL待測(cè)樣品，陰性對(duì)照加20μL培養(yǎng)基，以順鉑作陽性對(duì)照。置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，加入50 μL 50%冷三氯醋酸固定細(xì)胞，4℃放置1 h后用蒸餾水洗滌5次，空氣中自然干燥。然后加入4 mg/mL SRB溶液100μL/孔，室溫中染色30 min，去上清，用1%冰醋酸洗滌5次。最后加入10 mmol/mL的Tris溶液200μL/孔，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的吸光值(A)，用以下公式計(jì)算樣品對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率：

細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%) = (1-A樣品組/A對(duì)照組)×100%。

IC50值通過SigmaPlot 10.0軟件采用非線性曲線擬合的方法計(jì)算獲得，所有數(shù)據(jù)均通過三次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)獲得，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵提取物的抑菌活性 采用濾紙片擴(kuò)散法對(duì)6株大型真菌發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物進(jìn)行抗菌活性測(cè)試，結(jié)果顯示菌株紅汁乳菇G027的發(fā)酵提取物具有顯著的抑菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為25.00 mm和10.93 mm。革耳菌G028、鳥巢菌G026和光亮小紅孔菌G033的發(fā)酵提取物對(duì)金黃色葡萄球菌也有明顯的抑制作用，其抑菌圈直徑分別為18.23 mm、14.96 mm和14.30 mm(表2，圖1)。

2.2 發(fā)酵提取物的細(xì)胞毒活性 采用SRB法測(cè)試了6株大型真菌發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物對(duì)4種腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6株大型真菌的發(fā)酵提取物對(duì)4種腫瘤細(xì)胞株均有不同程度的抑制作用，其中紅汁乳菇G027發(fā)酵提取物的細(xì)胞毒活性最為顯著，對(duì)SF-268、MCF-7、NCI-H460、HepG-2細(xì)胞株的IC50值分別為2.02 μg/mL、1.53 μg/mL、2.35 μg/mL、1.87 μg/mL，與陽性對(duì)照藥對(duì)細(xì)胞株SF-268和NCI-H460的IC50值相當(dāng)，比陽性對(duì)照藥對(duì)細(xì)胞株MCF-7和HepG-2的IC50值還要低，說明該菌株的提取物具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。鳥巢菌G026對(duì)這4種腫瘤細(xì)胞株也有明顯的細(xì)胞毒活性，其IC50值分別為2.84 μg/mL、6.44 μg/mL、11.88 μg/mL、2.96 μg/mL，其它4株大型真菌的發(fā)酵提取物也具有一定的細(xì)胞毒活性，對(duì)腫瘤細(xì)胞MCF-7的IC50值在9.49～16.04 μg/mL之間。

表2 6株大型真菌發(fā)酵提取物的抑菌活性

注：“-”表示未測(cè)定抑菌活性。

a：紅汁乳菇G027；b：革耳菌G028；c：黑蛋巢菌G026；d：光亮小紅孔菌G033a: Lactarius hatsudake G027; b: Panus sp. G028; c: Cyathus sp. G026; d: Pycnoporellus fulgens G033

表3 6株大型真菌發(fā)酵提取物的細(xì)胞毒活性±s, n=3)

3 討論

紅汁乳菇是一種美味的食用菌，富含維生素、氨基酸、蛋白質(zhì)、纖維素，具有高蛋白低脂肪的特點(diǎn)，長(zhǎng)期食用具有一定的保健作用[9,10]。王軍等[11]發(fā)現(xiàn)紅汁乳菇子實(shí)體提取物具有抗菌活性。Gao等[12]和Zhang等[13]從紅汁乳菇中分離的4個(gè)麥角甾醇衍生物中，發(fā)現(xiàn)ergosterol peroxide和一個(gè)新化合物5,8-epi-dioxy- (24S)-ergosta-6-en-3-ol對(duì)PLA2酶和HIV病毒有抑制作用。據(jù)記載，紅汁乳菇還有抑制腫瘤的作用[14]。黑蛋巢菌屬(Cyathus Hall.:Pers.)的部分種為藥用真菌，如糞生黑蛋巢[C. stercoreus (Schw.) de Toni]與隆紋黑蛋巢[C. striatus (Hunds.: Pers.) Willd.]可用于治療胃病[15]。Allbutt等[16]發(fā)現(xiàn)海蓮娜黑蛋巢(C. helenae Brodie)能產(chǎn)生鳥巢菌素(Cyathin)的抑菌物質(zhì)。革耳屬(Panus Fr.)的有些種類也可以入藥，如紫革耳[Panus conchatus (Bull.) Fr.]用于治療腰酸腿疼，手足麻木，并具有抑腫瘤作用[15]。Lorenzen等[17]從革耳菌Panus sp.9096中分離出兩個(gè)倍半萜naematolin和namatolon，有文獻(xiàn)報(bào)道[18]namatolon可通過抑制胸腺嘧啶加入到DNA而抑制人食道癌細(xì)胞Eca-109的增殖。靈芝入藥已有2000多年的歷史，其藥用功效豐富，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、護(hù)肝、抗氧化、抗輻射等多種作用[19]。有柄靈芝民間用于治療胃病[20]。菌核斗菇是熱帶地區(qū)的一種珍貴食用菌兼藥用菌，其子實(shí)體與菌核皆能食用，已有文獻(xiàn)報(bào)道其發(fā)酵產(chǎn)物具有抗菌活性[21]，其子實(shí)體具有抗腫瘤[22]作用。

本研究發(fā)現(xiàn)菌株紅汁乳菇G027和黑蛋巢菌G026的發(fā)酵提取物具有顯著的抑菌和細(xì)胞毒活性。目前對(duì)紅汁乳菇的化學(xué)成分及其生物活性研究都基于其子實(shí)體，而未見對(duì)其菌株的發(fā)酵產(chǎn)物開展研究。由于紅汁乳菇是外生菌根菌，尚不能人工栽培，野生資源稀少，因此，通過分離菌株的發(fā)酵產(chǎn)物研究活性成分是開發(fā)利用紅汁乳菇的一條重要途徑。革耳菌G028的發(fā)酵提取物也具有較好的細(xì)胞毒活性，而且對(duì)金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用；菌核斗菇G025的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)腫瘤細(xì)胞株MCF-7具有明顯的細(xì)胞毒活性，但其抗菌活性并不明顯，這可能與文獻(xiàn)報(bào)道[21]的液體發(fā)酵條件和提取方法不同有關(guān)。此外，本研究還首次發(fā)現(xiàn)光亮小紅孔菌G033對(duì)金黃色葡萄球菌和腫瘤細(xì)胞株MCF-7具有明顯的抑制作用。因此，這6株大型真菌具有重要的研究?jī)r(jià)值，值得進(jìn)一步對(duì)其活性代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，有望從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離出新型的抗菌或抗腫瘤活性化合物。

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Studyonantibacterialandcytotoxicactivitiesoffermentationextractsfromsixmacrofungalstrains

CHEN Yu-chan1, LV Hua-ming2, TAN Guo-hui1, LI Hao-hua1, LI Sai-ni1, ZHANG Wei-min1*

1.State Key Laboratory of Applied Microbiology, South China (The Ministry—Province Joint Development),Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application; Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology;Guangdong Institute of Microbiology, Guangdong Province,Guangzhou 510070, China;2. College of Agriculture and Biology, Dali University,Yunnan Province, Dali 671003, China

Objective To investigate antibacterial and cytotoxic activities of fermentation extracts from six macrofungal strains of Guangdong province (Lactarius hatsudake G027, Cyathus sp. G026, Panus sp. G028, Pycnoporellus fulgens G033, Lentinus tuber-regium G025 and Ganoderma gibbosum G0?). Method Antibacterial and cytotoxic activities of fermentation extracts were examined by the filter paper dispersion method and the Sulforhodamine B (SRB) method, respectively. Results: Four strains (G027, G028, G026 and G033) showed significant anti-Staphylococcus aureus activity with inhibition zones of 25.00, 18.23, 14.96 and 14.30 mm respectively. The six strains displayed different degrees of cytotoxic activity against human tumor cell lines SF-268, MCF-7, NCI-H460 and HepG-2, among which the strain G027 exhibited the strongest cytotoxicity against the four tumor cell lines with IC50 values of 2.84, 6.44, 11.88 and 2.96 μg/mL, respectively. Conclusion The six macrofungal strains showed antibacterial and/or cytotoxic acitivities and deserved further study.

Macrofungus; fermentation; antibacterial; cytotoxic

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009B020201012)；廣東省科學(xué)院青年科學(xué)研究基金項(xiàng)目(qnjj201009)。

陳玉嬋，女，碩士，主要從事藥用微生物代謝產(chǎn)物活性評(píng)價(jià)，E-mail：yuchan2006@126.com。

章衛(wèi)民， E-mail：wmzhang58@qq.com。

R285.5

A

1007-8517(2014)09-0017-04

2014.03.05)