楊宏武 樓小亮 胡雪勇 李曉萍 周征成 席秋江

(南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江西 南昌 330003)

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，神經(jīng)細(xì)胞不能再生，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，成年哺乳動物腦組織中廣泛存在神經(jīng)干細(xì)胞(NSC)，且具有多向分化潛能及自我更新的特性〔1,2〕。Nestin為第Ⅵ類中間絲蛋白，為大多數(shù)增生活躍的神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)，故被認(rèn)為是NSC或神經(jīng)前體細(xì)胞的標(biāo)志之一〔3〕。本實驗通過TTC染色測定腦缺血后大鼠梗死體積以及采用免疫組化法測定不同時間點(diǎn)BrdU陽性細(xì)胞及Nestin的表達(dá)，進(jìn)一步來探討缺血性腦卒中后NSC的增殖、分化情況及神經(jīng)功能重建研究，了解腦心通膠囊是否能激活NSC，為缺血性腦血管病的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 選用健康雄性SD大鼠，體重250～300 g，鼠齡7～8 w，購自北京華阜康生物科技有限公司，SPF級〔合格證號：scxk(京)2009-0004〕。實驗分兩部分進(jìn)行：第一部分TTC染色及腦梗死體積測定，第二部分為BrdU及Nestin免疫組化。每一部分實驗使用SD大鼠68只，隨機(jī)分成四組：假手術(shù)組(8只)；MCAO模型組(20只)；MCAO+腦心通膠囊低劑量組(20只)；MCAO+腦心通膠囊高劑量組(20只)，兩部分實驗分組相同。每組再按照腦缺血再灌注(IR)后第3天、第7天、第14天和第21天分為四個時間點(diǎn)，模型組、腦心通低劑量組和腦心通高劑量組每個時間點(diǎn)各5只SD大鼠，而假手術(shù)組作為對照組，因不造成大腦中動脈閉塞(MCAO)，故每個時間點(diǎn)各2只SD大鼠。

1.2動物模型制作 參照Koizumi等〔4〕線栓法并進(jìn)行部分改良，使用購買的特制MCAO線栓(北京沙東生物技術(shù)有限公司)，具體如下：將SD大鼠稱重后按0.3 ml/100 g劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，將其仰臥姿勢固定在手術(shù)臺上，取頸部正中切口，分離肌肉組織，暴露頸部動脈，小心剝離右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈及伴行的迷走神經(jīng)，以絲線結(jié)扎右頸總動脈近心端、右頸外動脈，頸總動脈遠(yuǎn)心端近分叉處置一根線，不要系緊，動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈(ICA)近分叉處，在距頸總動脈分叉10 mm處剪一小口，將栓線插入到ICA，用繞在頸總動脈遠(yuǎn)心端的細(xì)線輕輕系牢拴線，松開ICA上的動脈夾，用鑷子輕推栓線，將距頭端20 mm的黑色標(biāo)記送入分叉處,遇到輕微阻力時停止，并稍微回拉約1～2 mm，2 h后小心抽出栓線進(jìn)行缺血再灌注，實驗鼠麻醉清醒后按Berderson等〔5〕評分法進(jìn)行神經(jīng)功能評分。假手術(shù)組僅將栓線插至頸總動脈內(nèi)，栓線深度小于10 mm，不阻斷大腦中動脈血流。

1.3BrdU和腦心通給藥 腦心通膠囊由黃芪、赤芍、丹參、川芎、桃仁、紅花、水蛭等十六味中藥制成的純中藥制劑，陜西步長制藥有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：120206。將膠囊中的腦心通粉末溶于蒸餾水中配成溶液，濃度為5 g/100 ml，根據(jù)人類和大鼠用藥比例進(jìn)行換算，確定腦心通高劑量組實驗鼠每次按50 mg/100 g灌胃給藥，2次/d，腦心通低劑量組實驗鼠按每次25 mg/100 g灌胃給藥，2次/d，模型組以蒸餾水灌胃。將BrdU粉末按10 mg/ml溶解于生理鹽水中，置4℃冰箱備用。根據(jù)實驗鼠體重，各組試驗鼠在處死前2 d即造模后第1、2天，第5、6天，第12、13天，第19、20天分別按100 mg/kg劑量腹腔注射，2次/d。

1.4TTC染色 缺血再灌注后第3、7、14、21天，將實驗鼠麻醉后迅速斷頭取腦，切除嗅球和低位腦干，標(biāo)本放置于-20℃冰箱內(nèi)稍冷凍后取出，自前腦額極起向后連續(xù)切片，一般切成5～6 μm厚度相近的冠狀腦切片。將腦片置于2%TTC溶液中，37℃恒溫箱中避光孵育30 min。正常腦組織可染成深紅色，梗死灶為白色，數(shù)碼照相機(jī)拍照。所得圖片用Image-pro plus6.0圖像分析軟件計算腦梗死體積〔6〕。

1.5免疫組織化學(xué)方法 大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，用4℃ 4%多聚甲醛固定液250 ml灌流固定，斷頭取腦，腦組織用4℃ 4%多聚甲醛溶液固定約12 h，后轉(zhuǎn)入蔗糖(4℃)溶液中，當(dāng)腦組織沉入蔗糖溶液底部后行恒冷箱冰凍切片，參考《大鼠腦立體定向圖譜》，以前囟后3.14～4.52 mm為海馬區(qū)部位，前囟后0.3～1.2 mm為側(cè)腦室連續(xù)冠狀切片，切片以0.1%多聚賴氨酸處理。用0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次20 min后，加入0.3%TritonX-100/PBS液中破膜及0.3% H2O2中去除過氧化物酶，切片標(biāo)本放置30 min。2N HCL 30 min后0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次10 min。含2%正常羊血清(NGS)和3% BSA的0.01 mol/L PBS ，室溫30 min；加入小鼠抗Brdu (1∶50 ZM-0013中杉金橋)和兔抗Nestin(1∶50 BA-1289 BOSTER)4℃孵育24 h，注意避光。0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次10 min。加入山羊抗小鼠 IgG/FITC(1∶100 ZF-0312中杉金橋)和山羊抗兔 IgG/TRITC(1∶100 ZF-0316中杉金橋)，室溫孵育2 h，注意避光。0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次10 min，注意避光。10%甘油/PBS封片，注意不要產(chǎn)生氣泡，將封好的切片放入切片盒，避光熒光顯微鏡下拍照保存。各組另取兩張片為陰性對照，一張不加入一抗，另一張不加入二抗，余步驟同上。切片標(biāo)本在熒光顯微鏡統(tǒng)一放大倍數(shù)(10×20)下，設(shè)置同樣面積的檢測窗口，隨機(jī)挑選5個視野，分別測其缺血側(cè)SGZ、SVZ區(qū)的BrdU陽性細(xì)胞和Nestin的熒光強(qiáng)度值并求均值，作為此張片的平均熒光強(qiáng)度值。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS16.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1TTC染色及腦梗死體積測定 造模后實驗鼠缺血側(cè)大腦半球均出現(xiàn)不同程度的梗死，TTC染色為大小不等的蒼白病灶，而對側(cè)正常腦組織被染成均勻紅色(圖1)。模型組、腦心通低劑量組及腦心通高劑量組大鼠不同時間點(diǎn)腦梗死體積，從表1可以看出，IR后第7天各組大鼠腦梗死體積最大；各組間不同時間點(diǎn)的變化趨勢也不一樣，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。腦心通高、低劑量組與模型組梗死體積相比較有顯著差異(P<0.05)，不同劑量腦心通組間差異顯著(P<0.01)。

圖1 各組大鼠第7天腦組織TTC染色

組別腦IR時間3 d7 d14 d21 dMCAO模型組33.8±0.9840.1±2.4331.9±1.3229.6±0.63腦心通低劑量組32.2±0.711)35.7±1.041)31.4±1.121)28.0±1.361)腦心通高劑量組31.7±0.641)2)33.2±1.101)2)29.2±1.211)2)26.4±1.991)2)

2.2各組實驗鼠不同時間點(diǎn)BrdU陽性細(xì)胞和Nestin的表達(dá) 免疫熒光染色顯示，腦缺血再灌注損傷后，模型組、腦心通低劑量組及腦心通高劑量組實驗鼠缺血側(cè)SVZ及SGZ區(qū)域可見BrdU標(biāo)記的陽性細(xì)胞和Nestin的表達(dá)，而假手術(shù)組中未發(fā)現(xiàn)表達(dá)(圖2)。除假手術(shù)組外，各組實驗鼠不同時間點(diǎn)BrdU陽性細(xì)胞和Nestin的平均熒光強(qiáng)度值發(fā)生變化，且呈現(xiàn)一定的規(guī)律性：IR后第3天平均熒光強(qiáng)度值較低，但隨時間逐漸升高，至第7天時達(dá)到最高，后又逐漸降低，至第14天時低于第7天，而第21天又較第14天低，但仍高于第3天。見表2。各組內(nèi)不同時間點(diǎn)BrdU陽性細(xì)胞和Nestin的平均熒光強(qiáng)度值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，但模型組與腦心通低劑量組、腦心通高劑量組之間比較，未發(fā)現(xiàn)腦心通對缺血側(cè)BrdU陽性細(xì)胞和Nestin的表達(dá)有促進(jìn)作用，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；腦心通高、低劑量組之間比較差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2各組腦組織SVZ區(qū)Nestin、BrdU熒光圖片(×200)

組別BrdUIR 3 dIR 7 dIR 14 dIR 21 dNestinIR 3 dIR 7 dIR 14 dIR 21 dSVZ區(qū)MCAO模型組6.075±0.841)10.685±0.617.323±0.411)7.250±0.661)2)3)10.354±0.301)17.793±0.6514.614±0.641)12.079±0.421)2)3)腦心通低劑量組6.162±0.831)10.780±0.737.484±0.521)7.203±0.591)2)3)10.353±0.441)17.583±0.7914.751±0.311)12.390±0.681)2)3)腦心通高劑量組6.143±0.171)10.676±0.757.415±0.451)7.219±0.511)2)3)10.344±0.331)17.327±0.3415.019±0.291)12.331±0.551)2)3)SGZ區(qū)MCAO模型組8.640±0.421)16.739±0.4813.180±0.361)10.374±0.411)2)3)11.761±0.491)19.984±0.4516.362±0.7514.190±1.061)2)3)腦心通低劑量組8.528±0.411)16.982±0.8613.295±0.431)10.739±0.661)2)3)11.883±0.541)19.878±0.641)16.341±0.831)14.332±0.591)2)3)腦心通高劑量組8.522±0.211)17.029±0.3113.817±0.731)10.786±0.801)2)3)11.466±0.881)20.004±0.6616.460±0.831)14.391±0.621)2)3)

3 討 論

近年來，NSC的研究成為關(guān)注的重點(diǎn)，正常生理情況下，這些細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)出現(xiàn)缺血等腦損傷后，它們能被激活，在損傷原位或異位進(jìn)行增殖后，在趨化因子的幫助下，遷移到損傷部位并進(jìn)行分化〔7，8〕，參與神經(jīng)再生及功能重建，但這種代償反應(yīng)的作用不明顯，因此充分誘導(dǎo)內(nèi)源性NSC活化增殖，定向分化為神經(jīng)元，可能是促進(jìn)腦缺血損傷后神經(jīng)功能重建的有效途徑之一，研究也證實，增強(qiáng)腦IR后神經(jīng)發(fā)生可以促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)〔9〕。

眾多國內(nèi)學(xué)者報道，傳統(tǒng)中醫(yī)藥如黃芪、川芎等具有促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用〔10，11〕，但是不是所有的中成藥都具有相同的作用呢？筆者選用腦心通膠囊來進(jìn)行本次實驗，它是由黃芪、赤芍、丹參、川芎、桃仁、紅花、水蛭等十六味中藥制成的純中藥制劑，方中以黃芪為君藥，大補(bǔ)元?dú)?，通過補(bǔ)氣使元?dú)獬涫?，發(fā)揮益氣活血之效；臣藥是蟲類藥水蛭、地龍、全蝎，其藥性善走，破血逐瘀，能搜剔絡(luò)中之邪，發(fā)揮通經(jīng)透絡(luò)之功效；佐藥為當(dāng)歸、川芎、丹參、赤芍、紅花等九味活血化瘀藥，共助君藥及臣藥疏通瘀阻之力；桑枝、桂枝針對上肢半身不遂，可引藥直達(dá)病所，溫經(jīng)通脈；牛膝逐瘀血，通經(jīng)絡(luò)，引血下行共為使藥〔12〕；諸藥配伍，主次得當(dāng)，標(biāo)本兼治，益氣活血，化瘀通絡(luò)，能抑制血小板的聚集，防止血栓形成，對腦組織具有保護(hù)作用。動物實驗也證實，腦心通膠囊能減少腦缺血大鼠梗死體積，對大鼠局灶性腦IR后神經(jīng)細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用〔13～15〕。本實驗顯示不同劑量腦心通可減少IR大鼠的梗死體積，且存在量效關(guān)系。但是，腦心通是否能促進(jìn)腦缺血損傷后NSC的增殖、分化，需要繼續(xù)通過動物實驗來明確。

本文結(jié)果表明模型組、腦心通低劑量組和腦心通高劑量組BrdU陽性細(xì)胞及Nestin在第3天已出現(xiàn)表達(dá)，不同時間點(diǎn)的BrdU陽性細(xì)胞和Nestin平均熒光強(qiáng)度值發(fā)生變化，第7天時為最高，后逐漸下降，第14天時低于第7天，第21天又較第3天時低，這和其他研究結(jié)果基本一致〔16〕。而假手術(shù)組中，本文在海馬齒狀回及室管膜區(qū)未發(fā)現(xiàn)有BrdU陽性細(xì)胞和Nestin表達(dá)。另外，我們通過給予不同劑量的腦心通進(jìn)行灌胃給藥，而模型組給予蒸餾水灌胃，三組之間任意兩組進(jìn)行比較，BrdU陽性細(xì)胞和Nestin的平均熒光強(qiáng)度值無明顯差異，未發(fā)現(xiàn)腦心通膠囊具有促進(jìn)IR后NSC增殖的作用。這與國內(nèi)其他學(xué)者的研究結(jié)果不一致，分析可能的原因有：①本文采用的是灌胃給藥方式，膠囊中的藥物粉末溶于蒸餾水再按不同劑量進(jìn)行灌胃，經(jīng)過胃吸收進(jìn)入血液后透過血腦屏障的藥物成分有限；②實驗的樣本量還不夠大。當(dāng)然，也不排除腦心通膠囊不具備促進(jìn)IR后NSC增殖的作用。

綜上所述，腦IRI后，NSC能發(fā)生反應(yīng)性增殖，但作用有限，外源性干細(xì)胞又受到干細(xì)胞來源不足、移植成功率低、免疫排斥和社會倫理學(xué)等問題的限制。因此，本文希望能發(fā)現(xiàn)更切實有效的方法來促進(jìn)內(nèi)源性NSC的增殖、分化，從而恢復(fù)腦缺血損傷導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺損；我們也將通過更多的動物實驗來進(jìn)一步明確傳統(tǒng)中醫(yī)藥在神經(jīng)干細(xì)胞領(lǐng)域所發(fā)揮的作用。

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