劉 俊 楊 林

胃癌居我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率之首，早期胃癌的預(yù)后較好，但隨著胃癌的進(jìn)展，腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力不斷增加，預(yù)后也越來(lái)越差。報(bào)道指出，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是上皮細(xì)胞基因發(fā)生轉(zhuǎn)變的過(guò)程，是賦予腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的重要環(huán)節(jié)[1]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，多種惡性腫瘤的EMT過(guò)程均伴有細(xì)胞因子的參與[2]，為進(jìn)行進(jìn)一步研究，我們對(duì)白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)對(duì)胃癌的EMT影響過(guò)程進(jìn)行了觀察，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃癌細(xì)胞株(未分化)HGC-27(上海拜力生物科技有限公司)，IL-6試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司)，鼠抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、β-actin單克隆抗體(巴傲得生物科技有限公司)，Trizol試劑(Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(Genecopoeia公司)，熒光定量PCR試劑盒、BCA法微量蛋白質(zhì)濃度測(cè)量試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(Hyclone公司)，Rotor Gene 6000熒光定量 PCR儀(德國(guó)凱杰公司)，核酸蛋白質(zhì)測(cè)定儀(Eppendorf公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

取HGC-27細(xì)胞株，平均分為2組，分別為觀察組及對(duì)照組。2組在常規(guī)培養(yǎng)后，觀察組額外接受IL-6培養(yǎng)，培養(yǎng)濃度為50 ng/ml，培養(yǎng)時(shí)間為3 d，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5%CO2。

1.3 觀察指標(biāo)

首先在光學(xué)顯微鏡下，觀察2組細(xì)胞培養(yǎng)后形態(tài)學(xué)變化，并采取逆轉(zhuǎn)錄法及熒光定量RT-PCR法[3]，觀察EMT標(biāo)志分子的變化，包括細(xì)胞表面蛋白(E-cadherin、N-cadherin)及細(xì)胞骨架蛋白(Vimentin)，分析IL-6對(duì)觀察組細(xì)胞株EMT的作用。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

對(duì)本研究的所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進(jìn)行分析，對(duì)計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)定為α=0.05，當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-6處理后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

顯微鏡觀察經(jīng)IL-6處理后，觀察組細(xì)胞連接疏松，多邊樣形態(tài)消失，部分細(xì)胞呈梭形(圖1-B)，而對(duì)照組細(xì)胞未見(jiàn)明顯改變，仍具有緊密的細(xì)胞連接(圖1-A)。

圖1 未經(jīng)IL-6處理及處理后胃癌細(xì)胞株形態(tài)比較(×100)

2.2 DNA表達(dá)結(jié)果比較

經(jīng)IL-6處理后，觀察組E-cadherin DNA表達(dá)量較對(duì)照組顯著下降，其N(xiāo)-cadherin、Vimentin DNA表達(dá)量顯著上升(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 2組細(xì)胞株DNA表達(dá)情況比較

2.3 蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果比較

經(jīng)IL-6處理后，觀察組E-cadherin 蛋白質(zhì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著下降，其N(xiāo)-cadherin、Vimentin 蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著上升(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 2組細(xì)胞株蛋白質(zhì)表達(dá)情況比較

3 討論

EMT是一種常見(jiàn)的生理現(xiàn)象，其與胚胎的早期發(fā)育、傷口的愈合具有密切聯(lián)系，同時(shí)，EMT也是一種病理現(xiàn)象，隨著上皮細(xì)胞極性的丟失，細(xì)胞的粘附性和連接的緊密度顯著下降，這也是導(dǎo)致腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的重要原因[4]。研究表明，胃癌組織的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜上均可見(jiàn)IL-6高表達(dá)，且伴有少量炎性細(xì)胞陽(yáng)性狀態(tài)，提示IL-6在胃癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面可能發(fā)揮了一定作用[5]。

為探討IL-6在胃癌中的具體作用，我們選取HGC-27胃癌細(xì)胞株進(jìn)行了體外培養(yǎng)，并發(fā)現(xiàn)經(jīng)IL-6處理后，觀察組細(xì)胞連接疏松，多邊樣形態(tài)消失，部分細(xì)胞呈梭形，而對(duì)照組細(xì)胞未見(jiàn)明顯改變，仍具有緊密的細(xì)胞連接，這說(shuō)明IL-6對(duì)胃癌細(xì)胞株形態(tài)的改變十分明顯。IL-6可將胃癌細(xì)胞株的上皮形態(tài)由多邊樣改變?yōu)槔w維樣，這使得細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的間質(zhì)樣改變，出現(xiàn)EMT效應(yīng)[6]。而腫瘤出現(xiàn)EMT效應(yīng)的表現(xiàn)不僅僅在于形態(tài)學(xué)的變化，其生物學(xué)行為亦會(huì)發(fā)生改變。我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IL-6處理后，觀察組E-cadherin DNA、蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著下降，而N-cadherin、Vimentin DNA、蛋白表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的DNA表達(dá)下調(diào)提示其對(duì)細(xì)胞形態(tài)的維持作用下降，同時(shí)，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及粘附現(xiàn)象亦受到了影響。在正常細(xì)胞內(nèi)，E-cadherin一般表達(dá)于細(xì)胞邊緣區(qū)域，且表達(dá)狀態(tài)十分穩(wěn)定，而腫瘤區(qū)域多見(jiàn)不均勻表達(dá)或表達(dá)缺如[7]，說(shuō)明E-cadherin在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。而N-cadherin具有強(qiáng)鈣粘附性，在分化和形成的胚胎組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性，且一般僅表達(dá)于睪丸支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞，主要起到抑制細(xì)胞凋亡的作用[8]。然而，經(jīng)IL-6處理后，胃癌細(xì)胞株N-cadherin表達(dá)顯著上升，說(shuō)明IL-6對(duì)細(xì)胞凋亡機(jī)制存在影響，使得細(xì)胞正常凋亡受到影響，在腫瘤的形成過(guò)程中占據(jù)重要地位。波形蛋白Vimentin主要附著于細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體末端，在維持細(xì)胞骨架完整性、提供細(xì)胞靈活性等方面發(fā)揮作用[9]，隨著Vimentin DNA和蛋白表達(dá)量的上升，細(xì)胞的靈活性隨之增加，且骨架完整性得到增強(qiáng)，這體現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的增強(qiáng)和抵御自身免疫攻擊能力的上升，這是導(dǎo)致腫瘤惡化的重要因子。不論是從形態(tài)學(xué)觀察還是從EMT相關(guān)分子標(biāo)志物的檢測(cè)上來(lái)看，IL-6都是導(dǎo)致胃癌細(xì)胞株發(fā)生EMT的重要因子，其可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT過(guò)程的發(fā)生、發(fā)展，促進(jìn)腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)一步惡化[10]，而IL-6也可作為胃癌細(xì)胞EMT的重要標(biāo)志物，用于鑒定體內(nèi)腫瘤EMT的發(fā)生、判斷患者體內(nèi)腫瘤EMT的狀態(tài)。

綜上所述，IL-6可通過(guò)影響細(xì)胞表面蛋白和骨架蛋白的活性，影響細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和凋亡過(guò)程，是導(dǎo)致胃癌細(xì)胞株EMT的關(guān)鍵因子，同時(shí)，IL-6對(duì)胃癌細(xì)胞株EMT的促進(jìn)也是導(dǎo)致癌癥轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散、惡化的重要原因。

[1] Polk DB,Peek RM Jr.Helicobacter pylori:gastric cancer and beyond〔J〕.Nat Rev Cancer,2010,10(6):403-414.

[2] Ukaszewicz-Zaj?c M,Mroczko B,Gryko M,et al.Comparison between clinical significance of serum proinflammatory proteins (IL-6 and CRP) and classic tumor markers (CEA and CA 19-9) in gastric cancer〔J〕.Clin Exp Med,2011,11(2):89-96.

[3] 朱寶和,何裕隆,詹文華,等.EGCG 抑制 IL-6 誘導(dǎo)腫瘤血管生成的作用及機(jī)制〔J〕.中國(guó)普通外科雜志,2011,20(7):725-730.

[4] Szczepanik AM,Scislo L,Scully T,et al.IL-6 serum levels predict postoperative morbidity in gastric cancer patients〔J〕.Gastric Cancer,2011,14(3):266-273.

[5] 李建芳,吳熊焰,李 潔,等.胃癌患者白細(xì)胞介素 6 水平檢測(cè)的臨床意義〔J〕.診斷學(xué)理論與實(shí)踐,2012,11(3):302-305.

[6] Gabitass RF,Annels NE,Stocken DD,et al.Elevated myeloid-derived suppressor cells in pancreatic,esophageal and gastric cancer are an independent prognostic factor and are associated with significant elevation of the Th2 cytokine interleukin-13〔J〕.Cancer Immunol Immunother,2011,60(10):1419-1430.

[7] 鄭 亮,夏加增,裴 雷,等.胃癌患者血清 IL-6,CRP 水平的變化及其與腫瘤血管生成的關(guān)系〔J〕.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2011,31(7):1017-1020.

[8] 鐘善傳,劉滌瑕,涂 暉,等.IL-6,CEA,CA19-9 和 CA7-

2-4 對(duì)胃癌的診斷價(jià)值〔J〕.標(biāo)記免疫分析與臨床,2011,18(4):235-238.

[9] Jones SA,Scheller J,Rose-John S.Therapeutic strategies for the clinical blockade of IL-6/gp130 signaling〔J〕.J Clin Invest,2011,121(9):3375-3383.

[10] 朱寶和,何裕隆,詹文華,等.表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯下調(diào)胃癌細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的分子機(jī)制研究〔J〕.中華胃腸外科雜志,2011,14(8):631-635.