李 光，周海越，孫迎春

（1.長春中醫(yī)藥大學藥學院，吉林 長春 130117；2.東北師范大學物理學院，吉林 長春 130024）

0 引言

在自然界環(huán)境中電磁場以多種形式普遍存在于人們的生活中，雷電、各種無線信號、家用電器等都產(chǎn)生一定的電磁場.正常情況下，人體已經(jīng)適應普遍存在的電磁場，但外加高強度的電磁場對生物會有一定的影響.經(jīng)一定強度高壓芒刺靜電場預處理的大豆種子的發(fā)芽率明顯提高［1］，并能有效提高玉米種子的發(fā)芽率［2］.一定強度范圍的高壓芒刺靜電場作用于實驗鼠，能夠有效激發(fā)免疫細胞表面分子的表達［3］，抑制人肝癌細胞SMMC7721的生長［4］.

多年來化療是治療腫瘤的一個主要方法，但這種方法不能起到藥到病除的效果.化療的主要障礙是受藥物濃度及藥物毒性的限制，難以有足夠高濃度的化療藥物進入腫瘤內(nèi)部，若大大提高用藥量，則副作用會極大增加，使人難以承受.并且，腫瘤細胞內(nèi)自然表達耐藥基常產(chǎn)生耐藥性［5］.因此，很多研究人員嘗試提高化療藥物的增敏性.已有研究表明，一定的電場會使細胞膜脂質(zhì)雙分子層形成瞬時微孔，能夠瞬時增加細胞膜的通透性和膜的電導率［6］.當電場取消后，微孔會關(guān)閉，不會對細胞造成影響.電場中的腫瘤細胞膜出現(xiàn)的微孔能夠增強細胞膜的通透性，即增強了細胞的吞噬能力，減小了細胞膜對外來分子的排斥，也就是說，電場強迫抗癌藥物通過細胞膜進入細胞，從而有效提高化療藥物的細胞毒性［7－8］，另外，當給細胞施加一定強度的電場時，由于熱效應，細胞內(nèi)的溫度會明顯升高，這有利于抑制腫瘤細胞內(nèi)耐藥基因的表達［9］，從而降低腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性.本文以體外傳代培養(yǎng)的Hela細胞為對象，探討了電暈電場配合化療藥物5－Fu對人宮頸癌細胞HeLa的殺傷作用，發(fā)現(xiàn)電暈電場輔助化療藥物5－Fu能夠有效地殺傷體外培養(yǎng)的HeLa.

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)及分組

細胞培養(yǎng)：HeLa細胞（東北師范大學細胞與遺傳研究所提供）培養(yǎng)在37℃和5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基為質(zhì)量分數(shù)10%胎牛血清的RPMI 1640（Invitrogen Corporation）.取處于對數(shù)生長期的細胞，進行計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至5×104個／mL，分別以1和0.1mL／孔接種于6孔和96孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng).

分組：所有細胞分為Ⅰ和Ⅱ兩部分（每部分為不同電壓梯度處理組）.Ⅰ為單純電場處理部分，Ⅱ為電場聯(lián)合5－Fu處理部分.Ⅱ組細胞于次日加入5－Fu，最終濃度為1μg／mL，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)3h后，兩組細胞同時接受電場處理.

1.2 電場裝置及設(shè)定的場強梯度

圖1為電暈電場裝置.其中：A為控制開關(guān)；B為靜電高壓電源（0～250kV）；C為Q3－V型高壓靜電表（量程為0～30kV）.上下極板均采用長方形的鋁板，上極板固定等長度、等間距排列的金屬釘作為芒刺，以產(chǎn)生電暈電場，下極板接地，芒刺尖端與下極板間距離為2.5cm，電場處理細胞時將細胞培養(yǎng)板放在下極板正中.兩極板面積遠大于培養(yǎng)板面積，故細胞培養(yǎng)板內(nèi)部電場可視為均勻電場，且可忽略邊緣效應.電壓梯度為0，2，6，10，14kV，處理時間為30min／d，連續(xù)處理4d.

圖1 電場裝配圖

1.3 MTT法檢測細胞活性

將Ⅰ和Ⅱ組在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)細胞，每孔加入20μL MTT（5mg／mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去上清液，每孔再加入150μL DMSO，充分溶解后，用酶標儀（λ490nm）測定吸光度（A值），每個電場作用樣本設(shè)8個復孔.繪制吸光度曲線，用抑制率＝［（對照組A值－實驗組A值）÷對照組A值］×100%來計算電場對細胞增殖的抑制率.

1.4 FCM檢測細胞死亡率

用質(zhì)量分數(shù)為0.25%的胰蛋白酶消化6孔培養(yǎng)板中細胞，離心，PBS洗滌2次，加入0.05mg／mL的150μL PI染液，4℃避光染色30min.用FACScan流式細胞儀（美國B－D公司）檢測細胞死亡率，計算特異陽性細胞百分比.

1.5 統(tǒng)計學方法

采用非配對Student't檢驗，Origin軟件處理數(shù)據(jù).

2 實驗結(jié)果

2.1 單純電暈電場對HeLa細胞生長的影響

MTT檢測結(jié)果顯示，單純電暈電場對HeLa細胞生長的影響具有雙向性（見表1和圖2）.與對照組相比，在U≤2kV時，電場的作用促進了細胞的生長，在2kV電壓作用下，細胞活性是對照組的1.27倍，抑制率是為－27.0%，而在U≥6kV時，電暈電場對HeLa生長起到了抑制作用，在電暈電場電壓達到14kV時，細胞HeLa的活性僅是對照組的54.9%，抑制率高達45.3%（P＜0.01），而且隨著電場電壓的增加，對HeLa細胞生長的抑制程度增強.

2.2 電暈電場聯(lián)合5－Fu對HeLa細胞生長的影響

采用流式細胞儀檢測電暈電場聯(lián)合5－Fu作用的HeLa細胞結(jié)果見表2和圖3.各強度電場聯(lián)合藥物處理組致使HeLa細胞的死亡率均多于單純電場組（見表1）和單純加藥組（見表2中0kV組），且細胞死亡率隨電場強度增加而增加，與單純電場處理組不同的是細胞活性不具有刺激生長和抑制生長的雙向性.

表1 單純電暈電場對HeLa細胞生長抑制影響（，n＝8）

表1 單純電暈電場對HeLa細胞生長抑制影響（，n＝8）

電壓／kV抑制率／%0—2－27.06 5.610 22.41445.3

表2 FCM檢測電暈電場聯(lián)合5－Fu作用HeLa細胞的死亡率

圖2 電場強度與A值關(guān)系

圖3 場強與電暈電場聯(lián)合5－Fu作用后細胞死亡率關(guān)系

3 結(jié)論

本文以體外培養(yǎng)的HeLa細胞為對象，檢測了電暈電場與化療藥物聯(lián)合應用及單獨用藥對細胞的生長的影響.結(jié)果表明：5－Fu聯(lián)合電暈電場共同作用體外培養(yǎng)的HeLa細胞時，HeLa細胞的生長收到極大的抑制，細胞活性降低，而細胞死亡率增加，5－Fu聯(lián)合電暈電場共同作用對細胞的殺傷力既高于單純電暈電場的作用也高于單純5－Fu的作用.提示電暈電場與抗癌藥物聯(lián)合使用時能產(chǎn)生比抗癌藥物單獨作用時更大的細胞毒性.

［1］孫迎春，張羽，李麗雅，等.高壓芒刺靜電場預處理對大豆種子發(fā)芽的影響［J］.東北師大學報：自然科學版，2005，37（1）：54－56.

［2］孫迎春，丁會，徐麗紅，等.高壓芒刺靜電場預玉米種子發(fā)芽影響的實驗研究［J］.東北師大學報：自然科學版，2006，38（1）：84－86.

［3］孫迎春，劉曉冬，楊秀蘭，等.高壓芒刺靜電場對小鼠LFA－1和ICAM－1表達的影響［J］.分子科學學報，2005，21（5）：46－50.

［4］孫迎春，嚴羚瑋，金光輝，等.高壓芒刺靜電場對人肝癌細胞SMMC7721生長的影響［J］.中國醫(yī)學物理學雜志，2005，22（1）：391－392.

［5］孫敬儒，王子淑，劉一勇，等.電穿孔誘發(fā)細胞凋亡和提高抗癌藥物細胞毒性的研究［J］.四川大學學報：自然科學版，2002，39：170－174.

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［7］CEMAZAR M，MIKLAVCIC D，SCANCER J，et al.Increased platinum accumulation in SA－1tumor cells after in vivo electrochemotherapy with cisplatin［J］.British Journal of Cancer，1999，79（9／10）：1386－1391.

［8］SAUER H，PUTZ V，F(xiàn)ISCHER K，et al.Increased doxorubicin uptake and toxicity in multicellular tumor spheroids treated with DC electrical fields［J］.British Journal of Cancer，1999，80（8）：1204－1213.

［9］宋燕爽，劉洪隱，王立梅，等.加熱能明顯抑制腫瘤細胞多藥耐藥基因的表達［J］.中國腫瘤臨床，1996，23（5）：375.