韓海斌，周曉榕，龐保平，常 靜

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010019）

0 引言

亞洲小車蝗Oedaleus asiaticus（Bienko）是我國北方蝗蟲的優(yōu)勢種［1］，同時也是內(nèi)蒙古草原蝗蟲的優(yōu)勢種.亞洲小車蝗在內(nèi)蒙古的主要分布地區(qū)為錫林郭勒盟中西部至鄂爾多斯市東部的典型草原和荒漠草原地區(qū)，發(fā)生數(shù)量是所有蝗蟲的50%～60%，嚴(yán)重的時候甚至可以達(dá)到90%以上，是草原上最嚴(yán)重的成災(zāi)蝗蟲［2］.亞洲小車蝗發(fā)生為害早、且發(fā)生數(shù)量大的特點對受害作物危害嚴(yán)重，可導(dǎo)致受害作物減少50%以上的產(chǎn)量，甚至顆粒無收［3］.亞洲小車蝗對草原的危害更為嚴(yán)重，可破壞草原的自然生態(tài)平衡，使草場退化、沙化的速度加快，目前，已經(jīng)被認(rèn)定為草原退化的指示災(zāi)害種群［4］.因此，人們對亞洲小車蝗的遺傳多樣性進(jìn)行了大量研究［5－12］.

核糖體DNA（rDNA）是目前廣泛使用的細(xì)胞核DNA分子標(biāo)記，其編碼區(qū)的序列高度保守，間隔區(qū)的進(jìn)化速度大約與物種形成的進(jìn)程相仿［13－15］.rDNA中的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA－ITS）序列的進(jìn)化速率較快，可以提供較豐富的變異位點和信息位點［16］.前人已經(jīng)對許多物種的ITS序列做過研究［17］.王莉萍等對美洲斑潛蠅Liriomyza sativae Blanchard不同地理種群的ITS1序列進(jìn)行了分析研究［16］；李正西和沈佐銳（2002）對松毛蟲赤眼蜂Trichogramma dendrolimi Matsumura的不同地理種群的ITS2序列進(jìn)行了研究分析［18］，探討了它們之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系.

本文對內(nèi)蒙古地區(qū)15個地點亞洲小車蝗的一段rDNA序列進(jìn)行了擴(kuò)增、測序和比較分析.希望從分子水平闡述同種蝗蟲不同自然種群遺傳分化的機(jī)制，為其利用與綜合防治提供遺傳學(xué)方面的依據(jù)，從而為重災(zāi)蝗區(qū)蝗蟲的防治工作提供基礎(chǔ)資料.

1 材料與方法

1.1 蝗蟲樣本

本實驗所用的亞洲小車蝗15個不同地點的樣本均為內(nèi)蒙古的自然種群（見表1），選取成蟲個體進(jìn)行捕捉，然后用養(yǎng)蟲籠活體帶回實驗室中，用液氮速凍處理后放入－40℃的冰箱中保存.每個地理種群取5只蝗蟲進(jìn)行測序.

表1 亞洲小車蝗采集信息

1.2 蝗蟲基因組DNA提取

取亞洲小車蝗后足股節(jié)（＜50g），研磨成粉狀后放入離心管中備用.使用天根dp304動物基因組DNA提取試劑盒對研磨成粉的樣本進(jìn)行DNA的提取，放入－40℃冰箱中備用.

1.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測

PCR擴(kuò)增體系總體積為50μL，其中2μL模板DNA，5μL 10×PCR Buffer，4μL的dNTP mix，2μL引物（10μmol／L），0.6μL TaKaRa Taq（5U／μL）（大連寶生物工程有限公司），最后用ddH2O補至50μL.

引物序列參考文獻(xiàn)［15］，由上海生工生物工程股份有限公司合成（見表2）.

表2 引物序列

PCR反應(yīng)用BIO－RAD PCR儀進(jìn)行，反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性1min—55℃退火1min—72℃延伸1.5min，35個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存.

通過ADVANCE水平電泳儀，選用2%的瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測.

1.4 產(chǎn)物序列測定及序列分析

委托上海生工生物工程股份有限公司對產(chǎn)物進(jìn)行測序.序列測定的結(jié)果與GenBank中已知的蝗蟲：中華稻蝗Oxya chinensis formosana（登錄號為F385193.1），Chorthippus parallelus（登錄號為AY585651.1），小稻蝗Oxya hyla intricata（登錄號為 AF385196.1）、日本稻蝗Oxyajaponica japonica（登錄號為AF385194.1），臺灣小稻蝗Oxyapodisma（登錄號為AF385195.1）的rDNA序列進(jìn)行比對.用Clustal X軟件對rDNA序列進(jìn)行測定；用MEGA 4.0軟件［19］對序列特征和遺傳距離進(jìn)行計算；使用DNASP 5.10.1［20］和Excel軟件計算單倍型多樣性（Hd）、種群遺傳分化系數(shù)（FST）、基因流（Nm）、核苷酸多樣性（Pi）、平均核苷酸差異數(shù)（K）；采用Distance軟件計算地理距離；使用TFPGA進(jìn)行Mantel檢測；使用TCS對單倍型進(jìn)行分析并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖［21］.

2 結(jié)果與分析

2.1 序列堿基組成分析

測序結(jié)果經(jīng)與GenBank中已知蝗蟲序列的比較、剪切得到部分5.8S、全部ITS2和部分28S共288bp的rDNA序列.測試的15個種群的75個個體序列中，共有19個變異位點，其中包括16個堿基的替換（5個轉(zhuǎn)換和11個顛換）和3個堿基插入，占所測序列的6.60%；19個多態(tài)性位點中包括6個單變異多態(tài)性位點和13個簡約信息位點.序列中T、A、C和G堿基平均含量分別為19.9%，27.6%，19.3%和33.2%，G＋C（60.8%）含量高于A＋T（39.2%）含量，與已知GenBank中5種蝗蟲的對比序列堿基組成特點基本一致（平均堿基含量G＋C為63.8%，A＋T為36.2%）.

2.2 亞洲小車蝗種群內(nèi)遺傳多樣性分析

15個亞洲小車蝗種群的遺傳多樣性指數(shù)見表3.結(jié)果表明，15個種群的單倍型多樣性（Hd）在0.000～0.800之間，四子王旗和烏拉特中旗種群最高，察右后旗、巴林右旗和達(dá)茂旗種群最低；平均核苷酸差異數(shù)（K）在0.000～8.000之間，其中正鑲白旗種群最高，察右后旗、巴林右旗和達(dá)茂旗種群最低；核苷酸多樣性（Pi）在0.0000～0.0280之間，正鑲白旗種群最高，察右后旗、巴林右旗和達(dá)茂旗種群最低.說明在察右后旗、巴林右旗和達(dá)茂旗種群中沒有基因變異發(fā)生，四子王旗和烏拉特中旗種群變異產(chǎn)生的單倍型最多，正鑲白旗種群發(fā)生的變異位點最多.

2.3 亞洲小車蝗種群間遺傳多樣性分析

由表3可知，亞洲小車蝗15個地理種群的遺傳分化系數(shù)（FST）為0.0506～0.4028，正鑲白旗種群檢測到的FST值最小，烏拉特中旗種群檢測到的FST值最大，均值為0.1495；基因流（Nm）在0.2312～5.9336之間，固陽種群檢測到的值最大，察右后旗、巴林右旗和達(dá)茂旗種群檢測到的值最小，均值為1.9880.結(jié)果表明，15個種群之間存在一定的基因交流和遺傳分化.

表3 內(nèi)蒙古亞洲小車蝗15個地理種群遺傳多樣性指數(shù)

2.4 單倍型分析

本文的75條序列中鑒定出8個單倍型（見表4），其中有3個共享單倍型和5個獨享單倍型.Hap1被除烏拉特中旗種群以外的其他14個種群所共享，頻率為0.6800；Hap2被固陽種群與烏拉特中旗種群共享，頻率為0.0400；Hap3為克什克騰旗種群等9個種群所共享，頻率為0.2133；其他5個單倍型分別被烏拉特中旗種群、四子王旗種群、阿左旗種群和正鑲白旗種群獨享，頻率均為0.0133.四子王旗種群共有4個單倍型，在15個種群中最多；其次為烏拉特中旗種群，有3個單倍型；察右后旗、巴林右旗和達(dá)茂旗種群均只檢測出1個單倍型，結(jié)果表明在各種群內(nèi)存在一定的遺傳分化.

由單倍型網(wǎng)絡(luò)圖（見圖1）可知，由四子王旗種群和正鑲白旗種群獨享的單倍型Hap5和Hap8分離出其他單倍型而存在，說明四子王旗種群和正鑲白旗種群較其他種群變異程度大.Hap5經(jīng)6次變異形成Hap8，Hap6突變3次形成Hap3，Hap4和Hap7經(jīng)過4次突變均可形成Hap2.

表4 各單倍型頻率及在種群中的分布

2.5 遺傳距離和地理距離的相關(guān)性分析

使用TFPGA軟件對亞洲小車蝗15個種群的遺傳距離和地理距離進(jìn)行Mantel測定，結(jié)果見圖2、表5，回歸方程為y＝－8045.4 x＋565.8，相關(guān)系數(shù)r＝－0.1554（P＝0.8080＞0.05）.由此可見，本實驗研究的亞洲小車蝗15個種群間的遺傳距離與其地理距離間無顯著的相關(guān)關(guān)系.

圖1 單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 內(nèi)蒙古亞洲小車蝗15個種群的遺傳距離與地理距離間的回歸分析

3 討論

本文測定的rDNA的288bp序列中G＋C含量高于A＋T含量，與GenBank中已知蝗蟲的rDNA序列的堿基組成一致，但是與赤眼蜂［18］、褐飛虱、白背飛虱、灰飛虱［22］、米爾頓姬小蜂［23］的rDNA序列的堿基組成相反，與亞洲小車蝗線粒體基因［24］的堿基組成也相反，說明不同物種之間的rDNA序列堿基組成存在差異，且同一物種不同基因的堿基組成同樣存在差異.

種群遺傳分化系數(shù)FST是種群間遺傳分化的重要指標(biāo).Wright指出，F(xiàn)ST＜0.05，說明種群間分化很弱；0.05＜FST＜0.15，表示種群中等分化；0.15＜FST＜0.25，表示種群遺傳分化較大［25］.本文中FST平均值為0.1495，說明15個種群間的遺傳分化處于中等水平，群體中有14.95%的變異來自種群間，而有85.05%的變異來源于不同個體之間，個體間的變異大于種群間變異，這與李東偉等［5］運用RAPD和韓海斌等［12］運用微衛(wèi)星標(biāo)記對不同地點亞洲小車蝗遺傳多樣性研究的結(jié)果相似.

Whitlock和Mccauley認(rèn)為，種群間基因相互交流的增加會導(dǎo)致種群間遺傳分化的減?。?6］，所以，基因流Nm的存在是影響種群間遺傳分化的重要因素；Slatkin認(rèn)為，種群間的基因流可以阻止完全的基因固定和遺傳分化［27］.本文中Nm平均值為1.9880（1＜Nm＜4），15個種群間基因交流處于中等水平.

本文的研究結(jié)果表明，內(nèi)蒙古15個亞洲小車蝗種群的遺傳距離與地理距離無顯著相關(guān)性，這一結(jié)果與任竹梅等 對不同區(qū)域日本稻蝗Cytb基因序列和高書晶等 對亞洲小車蝗mtDNA ND1基因序列的研究結(jié)果一致.造成這一結(jié)果的原因可能是，本文所選的rDNA序列在遺傳上相對較為保守，進(jìn)化較慢，在不同地理區(qū)域的亞洲小車蝗間沒有達(dá)到足夠的變異；也可能是亞洲小車蝗的遷移能力較強，在不同地理種群間存在較強的基因交流.這一推論符合本實驗對基因流的研究結(jié)果.李東偉等［5］和韓海斌等［12］運用RAPD和微衛(wèi)星標(biāo)記對不同地點亞洲小車蝗遺傳多樣性研究的結(jié)果顯示，不同地點的亞洲小車蝗種群的遺傳距離與地理距離具有顯著的相關(guān)性，說明單一的基因序列所涵蓋的信息量難以實際反應(yīng)遺傳多樣性的全部規(guī)律［5，12］.因此，在下一步的研究中，應(yīng)該增加研究內(nèi)容所涵蓋的信息量和樣本量，對分子系統(tǒng)學(xué)的研究進(jìn)行更深入的探討.

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