童春義 ，李 芳， 卜曉英， 蔣 斌 ，張志美 ，唐鳳霞， 劉選明?

(1．湖南大學(xué) 生物學(xué)院,湖南 長沙 410082；2．植物功能基因組學(xué)與發(fā)育調(diào)控湖南省重點實驗室(湖南大學(xué))，湖南 長沙 410082； 3．吉首大學(xué) 林產(chǎn)化工工程湖南省重點實驗室，湖南 張家界 427000)

白藜蘆醇是一種在植物內(nèi)發(fā)現(xiàn)的天然抗氧化劑，主要存在于虎杖、葡萄、花生和松樹等70多種植物中.國內(nèi)外很多學(xué)者對白藜蘆醇的生物學(xué)功能進(jìn)行了深層研究，結(jié)果表明，其具有抗癌[1-2]、抗心血管疾病、抗突變、抗菌[3]、抗病毒、抗氧化[4]、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及雌激素調(diào)節(jié)等多方面有益于人類健康的生物藥理活性，研究前景廣闊.但是，長期以來，學(xué)者們主要注重于白藜蘆醇的預(yù)防作用研究[5]，而對于白藜蘆醇對損傷期間或后期的干預(yù)研究較少.因此本實驗著重研究白藜蘆醇作為一種潛在的有價值的藥物是否有治療效果.以模式細(xì)胞HeLa作為研究對象，以白藜蘆醇作為功能藥物，在構(gòu)建酒精損傷細(xì)胞的模型基礎(chǔ)上，從細(xì)胞與分子水平上研究其對酒精性細(xì)胞損傷的修復(fù)作用.

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 實驗試劑

白藜蘆醇(w白>98%，長沙唯爾生物科技公司)；無水乙醇(分析純，北京鼎國生物技術(shù)公司)；RPMI 1640培養(yǎng)基和小牛血清(HyClone)；噻唑藍(lán)(MTT，Genview)，Hoechst33342和溴化丙錠(Sigma)，總超氧化物歧化酶(T-SOD)與丙二醛(MDA)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所.

Hela細(xì)胞購自中南大學(xué)細(xì)胞庫，在本實驗室保存并培養(yǎng).

1.1.2 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；低溫高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；全自動酶標(biāo)分析儀 (美國Thermo公司)；紫外-可見分光光度計(北京萊伯科儀器有限公司)；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；熒光定量PCR儀(日本安捷倫公司)；超凈工作臺(江蘇蘇凈集團(tuán)安泰公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 酒精損傷細(xì)胞模型的建立與白藜蘆醇的干預(yù)

根據(jù)本實驗室前期篩選結(jié)果表明，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為4.8%的乙醇作用于Hela細(xì)胞12 h時，細(xì)胞具有一定的恢復(fù)，而濃度過高或者處理時間延長，細(xì)胞均出現(xiàn)無法恢復(fù)的情況，為此本實驗選擇體積分?jǐn)?shù)為4.8%的乙醇作用于Hela細(xì)胞12 h時建立酒精損傷模型[6].細(xì)胞換液時將白藜蘆醇(DMSO溶解)加入新鮮培養(yǎng)基中，按不同劑量(終濃度10～100 μM)分別在酒精損傷之前預(yù)處理細(xì)胞24 h(前處理組)、與酒精同時加入處理細(xì)胞12 h(同時處理組)、在損傷之后加入處理細(xì)胞24 h(后處理組)，檢測白藜蘆醇對酒精損傷的干預(yù)作用.每組實驗不少于3個平行，設(shè)置酒精損傷模型組與正常培養(yǎng)細(xì)胞組為對照組.選出修復(fù)效果最佳組合為干預(yù)組進(jìn)行后續(xù)實驗.

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將正常對照組、酒精損傷組與白藜蘆醇干預(yù)組的細(xì)胞用D-hank's清洗3遍，然后加入hoechst33342染液，終濃度為5 μg/mL，在室溫下避光染色10 min，繼續(xù)加入PI染液，終濃度為15 μg/mL，4 ℃下避光反應(yīng)10 min，D-hank's稍清洗一遍即可在倒置熒光顯微鏡下觀察并照相，觀察比對各組細(xì)胞的凋亡情況.

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析

將正常對照組、酒精損傷組與白藜蘆醇干預(yù)組的細(xì)胞用D-hank's清洗后，胰酶消化，D-hank's吹打均勻后4 ℃ 1 000 r/min離心5 min，去上清液，4 ℃預(yù)冷的70%酒精重懸細(xì)胞，4 ℃過夜后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率.

1.2.4 氧化損傷的生化指標(biāo)檢測

將正常對照組、酒精損傷組與白藜蘆醇干預(yù)組的細(xì)胞用D-hank's清洗3遍用胰酶消化，生理鹽水吹打均勻后，置于冰水混合物中超聲波破碎細(xì)胞，12 000 r/min低溫高速離心5 min后轉(zhuǎn)移上清液，上清液即為所提蛋白質(zhì)，用考馬斯亮藍(lán)法測量蛋白濃度后，按丙二醛(MDA)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)檢測試劑盒的說明書進(jìn)行生化活性指標(biāo)的檢測，評估白藜蘆醇干預(yù)酒精損傷的Hela細(xì)胞的機(jī)制是否與氧化損傷有關(guān).其中細(xì)胞MDA水平反映脂質(zhì)過氧化程度，T-SOD水平反映內(nèi)源抗氧化能力的大小.

1.2.5 熒光定量PCR

按實驗指導(dǎo)書中操作步驟提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以cDNA為模板做熒光定量PCR，分析各基因表達(dá)情況.反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min后進(jìn)入循環(huán)，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min.其中用到的相應(yīng)引物序列如表1所示.

表1 熒光定量PCR中用到的引物

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 白藜蘆醇對細(xì)胞受酒精損傷干預(yù)作用

在酒精損傷細(xì)胞前、中、后3個時期分別加入一系列濃度白黎蘆醇，以細(xì)胞存活率考查其干預(yù)效果，結(jié)果如圖1所示.白藜蘆醇先處理細(xì)胞和與酒精同時處理細(xì)胞，細(xì)胞都出現(xiàn)存活率下降的情況，而在酒精損傷后加入低劑量白藜蘆醇(10～50 μM)，細(xì)胞存活率出現(xiàn)一定程度的提高(相對于損傷模型，存活率提高0%～10%)，說明低劑量的白藜蘆醇減輕了酒精對細(xì)胞的損傷，或者說修復(fù)了酒精對細(xì)胞造成的部分損傷.為此，在酒精損傷細(xì)胞12 h后，加入20 μM白藜蘆醇處理24 h為白藜蘆醇干預(yù)組，來進(jìn)一步研究白藜蘆醇對酒精致氧化損傷細(xì)胞的修復(fù)作用.

RES濃度/μm

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析白藜蘆醇修復(fù)作用

對正常培養(yǎng)組細(xì)胞(a)、酒精損傷模型組細(xì)胞(b)和白藜蘆醇干預(yù)組細(xì)胞(c)進(jìn)行hoechst33342/PI染色，倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，如圖2所示，正常培養(yǎng)的Hela細(xì)胞呈規(guī)則梭形，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色(圖2(a))；經(jīng)酒精損傷后自我修復(fù)的細(xì)胞有近半數(shù)呈圓形，呈現(xiàn)凋亡形態(tài)，細(xì)胞核被染成紅色，說明半數(shù)細(xì)胞處在凋亡晚期或死亡(圖 2(b))；而白藜蘆醇干預(yù)的細(xì)胞仍大多呈梭形，細(xì)胞核大多變?yōu)榈{(lán)色為正常細(xì)胞，少數(shù)為亮藍(lán)色的凋亡早期細(xì)胞，極個別帶紅色為凋亡細(xì)胞(圖2(c)).由此結(jié)果我們推測，酒精損傷后細(xì)胞的自我修復(fù)能力差，損傷的細(xì)胞大多走向凋亡晚期甚至死亡；而在白藜蘆醇作用下，提高了細(xì)胞修復(fù)這種損傷的能力，使得細(xì)胞在培養(yǎng)過程中漸漸得到恢復(fù)，從而呈現(xiàn)早期凋亡或已恢復(fù)正常的細(xì)胞核狀態(tài).可見，白藜蘆醇有助于細(xì)胞恢復(fù)狀態(tài)，提高了細(xì)胞自我修復(fù)的能力.

圖2 Hela細(xì)胞形態(tài)的變化(200×)

2.3 白藜蘆醇干預(yù)對細(xì)胞周期的影響

通過流式細(xì)胞儀對正常培養(yǎng)組細(xì)胞、酒精損傷組細(xì)胞和白藜蘆醇干預(yù)組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析，結(jié)果如圖3所示．正常培養(yǎng)組細(xì)胞沒有出現(xiàn)明顯的凋亡峰(圖3(a))；酒精損傷組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡峰(圖3(b))；而白藜蘆醇干預(yù)組細(xì)胞的凋亡峰明顯變小(圖3(c)).這說明白藜蘆醇的干預(yù)能夠降低細(xì)胞凋亡率，說明在受到酒精損傷后，細(xì)胞自身24 h的恢復(fù)能力有限，而白藜蘆醇的干預(yù)能通過增強(qiáng)細(xì)胞活力來提高應(yīng)對損傷的能力，抑制了損傷細(xì)胞的凋亡.對細(xì)胞周期分析可知(如圖3(d))，酒精損傷組細(xì)胞主要是將細(xì)胞阻滯在S期，而白藜蘆醇的干預(yù)能消除這種阻滯，促進(jìn)細(xì)胞的分裂增殖從而達(dá)到修復(fù)細(xì)胞損傷的效果.

圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果

2.4 白藜蘆醇干預(yù)對細(xì)胞內(nèi)生化指標(biāo)的影響

MDA[7]是脂質(zhì)氧化損傷的經(jīng)典標(biāo)志物，其含量高低反映了細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度,而T-SOD[8]活性變化情況反映了細(xì)胞清除氧自由基的能力，測定MDA和T-SOD等細(xì)胞內(nèi)生化指標(biāo)，從生化角度驗證白藜蘆醇作用機(jī)理.結(jié)果如表2所示．酒精損傷組細(xì)胞的MDA含量相比于正常培養(yǎng)組細(xì)胞顯著增加，而經(jīng)白藜蘆醇干預(yù)組細(xì)胞則與正常培養(yǎng)的細(xì)胞無明顯差異.這說明酒精處理細(xì)胞引起脂質(zhì)過氧化物堆積，而細(xì)胞自身的修復(fù)能力有限，不足以清除這些多余的脂質(zhì)過氧化物，造成氧化損傷，白藜蘆醇的加入能顯著減少脂質(zhì)過氧化物堆積，減輕甚至修復(fù)了由酒精造成的氧化損傷.另外，酒精損傷組細(xì)胞內(nèi)T-SOD的活性與正常培養(yǎng)組細(xì)胞無顯著差異，這也說明細(xì)胞的自身修復(fù)效果不明顯，而白藜蘆醇可能大大增強(qiáng)了T-SOD的活性，提高了細(xì)胞抗氧化的能力，可以更好地修復(fù)酒精造成的氧化損傷.

表2 細(xì)胞內(nèi)MDA水平與T-SOD活性的變化

2.5 白藜蘆醇干預(yù)對氧化相關(guān)基因的影響

OGG1編碼的OGG1蛋白[9]主要識別和切除氧化損傷所產(chǎn)生的8-oxoG，一般認(rèn)為，OGG1的表達(dá)量增加，OGG1蛋白的活性增強(qiáng)，修復(fù)氧化損傷能力越強(qiáng).而ALDH2[10]是將乙醛繼續(xù)代謝成CO2和H2O的一種酶，ALDH2的表達(dá)量增加，ALDH2酶的活性增強(qiáng)，越能降低體內(nèi)乙醛堆積，減輕氧化損傷.采用定量PCR的方法檢測各實驗組細(xì)胞OGG1和ALDH2的mRNA水平表達(dá)量，結(jié)果如圖4所示，酒精損傷組的細(xì)胞OGG1和ALDH2的mRNA水平表達(dá)量略有下調(diào)，說明細(xì)胞的自我修復(fù)能力較弱，不足以修復(fù)酒精造成的損傷；而加入白藜蘆醇后的細(xì)胞OGG1和ALDH2的表達(dá)量均大大的上調(diào)，是正常培養(yǎng)組細(xì)胞的2倍左右，比損傷組細(xì)胞高出2～4倍，說明白藜蘆醇可通過上調(diào)這些基因的表達(dá)來增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)減輕和修復(fù)氧化損傷的能力.

圖4 白藜蘆醇干預(yù)對OGG1和ALDH2 mRNA水平表達(dá)量的影響

3 結(jié) 論

酒精進(jìn)入機(jī)體后，主要由細(xì)胞中的乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶、過氧化氫物分解酶等進(jìn)行代謝，乙醇在細(xì)胞代謝中產(chǎn)生乙醛，乙醛在代謝過程中產(chǎn)生大量活性氧自由基，攻擊細(xì)胞膜脂質(zhì)、蛋白和核酸，使細(xì)胞處于促氧化物質(zhì)明顯增多和抗氧化物質(zhì)明顯減少的氧化應(yīng)激狀態(tài)、最終損害細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，形成酒精致氧化損傷.白藜蘆醇能通過修復(fù)氧化損傷途徑來減輕甚至修復(fù)酒精對細(xì)胞造成的損傷.從細(xì)胞和生化角度看，白藜蘆醇能通過減少細(xì)胞內(nèi)氧化產(chǎn)物MDA的生成和增強(qiáng)抗氧化酶T-SOD的活性來抵御酒精對細(xì)胞造成的氧化損傷，表現(xiàn)為恢復(fù)細(xì)胞正確的細(xì)胞周期和減少凋亡；從分子水平看，白藜蘆醇通過上調(diào)氧化損傷修復(fù)基因OGG1與ALDH2的表達(dá)，提高細(xì)胞修復(fù)氧化損傷的能力.綜合上述結(jié)果推測，白藜蘆醇是一個很有價值的潛在修復(fù)氧化損傷藥物，本研究為白藜蘆醇作為治療藥物應(yīng)用提供了初步理論支持.

[1] ATHAR M, BACK J H, TANG X W,etal. Resveratrol: A review of preclinical studies for human cancer prevention[J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2007, 224(3): 274-283.

[2] GUPTA S C, KANNAPPAN R, REUTER S,etal. Chemosensitization of tumors by resveratrol [J]． Annals of the New York Academy of Sciences，2011, 1215: 150-160.

[3] 李永軍,李巍偉,王鑫,等.白藜蘆醇對葡萄球菌抗菌活性研究[J]．中國實驗診斷學(xué),2008, 12(1): 58-60.

LI Yong-jun, LI Wei-wei, WANG Xin,etal. Study of in vitro antibacterial activity of resveratrol[J]. Chinese Journal of Laboratory Diagnosis, 2008,12(1): 58-60.(In Chinese)

[4] YAN Y, YANG J Y, CHEN G L,etal. Protection of resveratrol and its analogues against ethanol-induced oxidative DNA damage in human peripheral lymphocytes [J]. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 2011, 721 (2): 171-177.

[5] ZHENG Y, LIU Y H, GE J Y,etal. Resveratrol protects human lens epithelial cells against H2O2-induced oxidative stress by increasing catalase, SOD-1, and HO-1 expression [J]. Molecular Vision，2010, 16: 1467-1474.

[6] AKBAY T T, SEHIRLI O, ERCAN F,etal. Resveratrol protects against methotrexate-induced hepatic injury in rats [J]．Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences, 2010, 13 (2): 303-310.

[7] ABOUL-ELA H M, SAAD A A, EL-SIKAILY A M A,etal．Oxidative stress and DNA damage in relation to transition metals overload in Abu-Qir Bay, Egypt[J]. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 2011, 9(1): 51-58

[8] AKSENOV M Y, AKSENOVA M V, BUTTERFIELD D A,etal. Protein oxidation in the brain in Alzheimer’S disease[J]． Neuroscience, 2001, 103(2):373-383.

[9] 夏春波, 蔣常文, 劉源劼, 等. OGG1 mRNA在鼻咽癌組織中的表達(dá)及其意義[J]. 實用醫(yī)學(xué)雜志，2010, 26(5): 729-731．

XIA Chun-bo, JIANG Cang-wen, LIU Yun-jie,etal. Expression of OGG1 mRNA in nasopharyngeal carcinoma and its significance[J]. The Journal of Practical Medicine 2010, 26(5): 729-731.(In Chinese)

[10]哈斯圖雅,畢力夫,蘇秀蘭.乙醛脫氫酶2(ALDH2)基因研究進(jìn)展[J]． 中國優(yōu)生與遺傳雜志, 2007,15(5): 3-4 .

HASITUYA, BL Li-fu, SU Xiu-lan. Progress on aldehyde dehydrogenase2(Aldh2) gene[J]. Chinese Journal of Birth Health & Heredity，2007,15(5): 3-4.(In Chinese)