何志堅(jiān) 鐘 睿 劉海云

胃癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居高不下，嚴(yán)重威脅人類的生命健康[1]，5-氟尿嘧啶(5-Fu) 是臨床上治療腫瘤的常用化療藥物，對(duì)腫瘤有一定的療效，但其不良反應(yīng)大，如骨髓抑制、口腔黏膜炎和外周神經(jīng)毒性等，甚至可引起急性心肌梗死和心源性休克，還可引起腦血管缺血[2]。有報(bào)道指出:中藥聯(lián)合化療藥物能顯著增強(qiáng)抗腫瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)、降低化療藥物的不良反應(yīng)[3]，本實(shí)驗(yàn)通過腫節(jié)風(fēng)注射液聯(lián)合應(yīng)用5-Fu，探討他們對(duì)抗人胃癌 MGC-803細(xì)胞增殖、粘附、凋亡和細(xì)胞周期的影響，為臨床治療腫瘤用藥開發(fā)和聯(lián)合用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

腫節(jié)風(fēng)注射液(劑量為生藥量)，規(guī)格：1 g/mL，2 mL/支，批號(hào)：20120618，福建古田藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；MGC-803細(xì)胞株購(gòu)自南京凱基生物公司；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司，批號(hào)755295)；小牛血清(杭州四季青生物工程研究所，批號(hào) 20120502)；二甲基亞砜(DMSO，上海生物工程公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT，美國(guó) Sigma 公司)；Trypsin，Solarbio(批號(hào) T8150)；Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(凱基生物，批號(hào) KGA106)；氟脲嘧啶(上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào) H31020593)。

1.2 儀器

酶標(biāo)儀550(BIO-RAD)；空氣凈化臺(tái)(蘇州三興凈化科技有限公司)；EPICSXL-流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼特公司)；臺(tái)式離心機(jī)(Eppendorf 公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞MGC-803培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，細(xì)胞在相對(duì)濕度為95%、37 ℃、5%CO2的環(huán)境中貼壁生長(zhǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 MTT檢測(cè)MGC-803細(xì)胞增殖抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC-803細(xì)胞，胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞懸液濃度達(dá)到1×105/mL，每孔加入100 μL細(xì)胞液于96孔培養(yǎng)板中，37 ℃、5%CO2過夜培養(yǎng)至細(xì)胞完全貼壁。待細(xì)胞貼壁后取出，隨機(jī)分為4 組，即中藥ZJF組、5-Fu 組、ZJF+5-Fu組及對(duì)照組，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，加入不同濃度的藥物，每種藥物濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，中藥ZJF組中藥濃度分別為 6.25、12.5、25、50 mg/mL，5-Fu 組5-Fu濃度分別為 0.0125、0.0250、0.0500、0.1000 mg/mL；按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，中藥ZJF+5-Fu組為中藥ZJF與5-Fu各自的最終濃度均需與單一用藥組一致。以雙倍濃度的ZJF及5-Fu等體積混合，即得到ZJF+5-Fu組藥物濃度分別為6.2625、12.525、25.05、50.10 mg/mL，對(duì)照組加入單純培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加20 μL MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清每孔加入150 μL DMSO,室溫低速震蕩10 min,待結(jié)晶物溶解后,于酶標(biāo)免疫測(cè)定儀測(cè)定490 nm處的吸光度D值。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組平均D值/對(duì)照組平均D值)×100%。

1.3.3 MTT法檢測(cè)MGC-803細(xì)胞粘附能力 將細(xì)胞種入直徑6 cm小皿中，4組細(xì)胞數(shù)為1×105/皿、貼壁后，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，加入含不同濃度藥物的 RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，消化細(xì)胞，離心重懸，保留小皿內(nèi)含藥培養(yǎng)液，用含藥培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)至1×106個(gè)/mL，接種于96孔板，1×105個(gè)/孔，每種密度設(shè)3個(gè)復(fù)孔；對(duì)照組加入無藥物的RPMI 1640培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)20、40、60 min，吸出培養(yǎng)液，用滅菌PBS小心清洗，每孔2次，洗去未黏附細(xì)胞；每孔加入100 μL 10%小牛血清 RPMI 1640+20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去全部上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩器振蕩10 min，使結(jié)晶完全溶解，在酶聯(lián)儀波長(zhǎng)490 nm處測(cè)出各孔A，以A 代表黏附細(xì)胞數(shù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)MGC-803細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)，將4組細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，每組細(xì)胞設(shè)4個(gè)復(fù)孔。然后按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，加入不同濃度的藥物。各處理組所加藥物濃度為 MTT 法計(jì)算所得0.1×IC50。37 ℃孵育48 h后，采用Annexin V-FITC 法檢測(cè)癌細(xì)胞凋亡，消化各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，收集于EP管中，PBS洗滌2次，用250 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，取195 μL的細(xì)胞懸液加入5 μL AnnexinV/FITC后，加入5 μL 20 μg/mL的PI(碘化丙錠)溶液室溫避光孵育15 min，轉(zhuǎn)入流式管中應(yīng)用流式細(xì)胞儀(FACScan，BD公司，美國(guó))分析。

2 結(jié)果

2.1 各組對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖抑制率的影響

ZJF、5-Fu 單用及合用均對(duì)MGC-803細(xì)胞有抑制作用，其抑制率與藥物濃度呈正相關(guān)。ZJF+5-Fu組對(duì)細(xì)胞增殖抑制率明顯高于5-Fu 組和ZJF組(P<0.05)，見表1。

表1 各組作用不同時(shí)間對(duì)MGC-803細(xì)胞抑制率的影響(﹪，

注：與ZJF+5-Fu組同濃度同時(shí)間點(diǎn)比較，①為P<0.05，②為P<0.01。

2.2 各組對(duì)MGC-803細(xì)胞粘附的影響

結(jié)果表明:ZJF組、5-Fu 組及ZJF+5-Fu組作用20、40、60 min 后，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞粘附率均明顯低于空白對(duì)照組，而ZJF+5-Fu組細(xì)胞粘附率明顯低于5-Fu 組和ZJF組(P<0.05)，且作用時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞粘附能力的抑制作用越強(qiáng)，見表2。

2.3 各組對(duì)MGC-803細(xì)胞凋亡率情況

各實(shí)驗(yàn)組凋亡率與對(duì)照組比較顯著升高；同一時(shí)間段2種藥物合用后細(xì)胞凋亡率均較相應(yīng)濃度單藥凋亡率高(P<0.05，P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，腫節(jié)風(fēng)注射液與5-Fu聯(lián)合用藥后對(duì)胃癌細(xì)胞的凋亡有明顯增強(qiáng)作用，見表3。

表2 各組對(duì)MGC-803細(xì)胞粘附能力的影響

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較,①為P<0.05，②為P<0.01；與ZJF+5-Fu組同時(shí)間點(diǎn)比較,③為P<0.05,④為P<0.01。

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)MGC-803細(xì)胞凋亡率情況 ﹪)

注：與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較，①為P<0.05，②為P<0.01；與ZJF+5-Fu組同時(shí)間點(diǎn)比較,③為P<0.05,④為P<0.01。

3 討論

化療是治療胃癌及胃癌術(shù)后的主要方法之一，而大劑量的藥物聯(lián)合化療，在治療癌癥病灶的同時(shí)，會(huì)引起機(jī)體的不良反應(yīng)，同時(shí)降低了機(jī)體的免疫力，制約了藥物的治療效果。因此，在化療的過程中，維護(hù)機(jī)體的免疫狀態(tài)和抗癌化療同樣重要。中醫(yī)治療是從整個(gè)機(jī)體出發(fā)，調(diào)整全身各系統(tǒng)、器官和組織的功能狀態(tài)，增強(qiáng)了因化療藥物使機(jī)體功能低下的免疫系統(tǒng)，間接對(duì)腫瘤細(xì)胞起抑制與殺傷作用，達(dá)到治療目的[4]。因此，中藥聯(lián)合化療藥增強(qiáng)機(jī)體免疫作用而達(dá)到抗腫瘤作用，同時(shí)還能降低骨髓抑制和消化道不良反應(yīng)的發(fā)生，在改善中晚期胃癌患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)患者的生存期的應(yīng)用中具有重要意義[5]。

腫節(jié)風(fēng)(ZJF)為金粟蘭科多年生草本植物草珊瑚的枝葉，內(nèi)含多種抗腫瘤有效成分[6]。5-Fu為1種嘧啶類似物，可在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化成不同的細(xì)胞毒性代謝產(chǎn)物，與DNA和RNA結(jié)合，最終通過抑制DNA合成導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡，當(dāng)腫節(jié)風(fēng)注射液與5-Fu等化療藥物聯(lián)用時(shí)具有協(xié)同作用。MTT法檢測(cè)腫節(jié)風(fēng)注射液聯(lián)合5-Fu對(duì)人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖抑制作用，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看腫節(jié)風(fēng)注射液可抑制MGC-803細(xì)胞生長(zhǎng)且具有明顯的時(shí)效和量效關(guān)系，即濃度越大，作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制作用也就越強(qiáng)。

本研究結(jié)果顯示腫節(jié)風(fēng)注射液對(duì)MGC-803胃癌細(xì)胞有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用。作用48 h后，凋亡率隨中藥濃度的增加明顯升高，腫節(jié)風(fēng)注射液與5-Fu聯(lián)合用藥比單獨(dú)使用效果更好，其機(jī)制可能與下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)，上調(diào)野生型P53基因表達(dá)有關(guān)。

總之，本研究結(jié)果表明腫節(jié)風(fēng)注射液與5-Fu聯(lián)合應(yīng)用能進(jìn)一步提高化療藥物療效，對(duì)胃癌細(xì)胞系MGC-803具有時(shí)間和濃度依賴性的抑制作用，抑制作用與抑制DNA合成和誘導(dǎo)凋亡有關(guān)，有關(guān)的分子機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

[1] 崔建成.奧沙利鉑、氟尿嘧啶聯(lián)合亞葉酸鈣治療晚期胃癌效果觀察〔J〕.山東醫(yī)藥,2010,50(51):85-86.

[2] Frickhofen N，Beck FJ，Jung B，et al.Capecitabine can induce acute coronary syndrome similar to 5-fluorouracil〔J〕.Ann Oncol，2002，13(5):797-801.

[3] 丁照黎.中西醫(yī)結(jié)合對(duì)腫瘤放化療患者的臨床影響觀察與分析〔J〕.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥,2011,6(7):185-186.

[4] 張國(guó)臣.胃癌術(shù)后化療聯(lián)合中醫(yī)治療研究進(jìn)展〔J〕.實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志,2011,25(8):28-31.

[5] 劉燕珠.中西醫(yī)結(jié)合治療中晚期胃癌臨床效果分析〔J〕.中醫(yī)臨床研究,2011,3(16):22.

[6] 趙長(zhǎng)琦，許有玲.抗腫瘤植物藥及其有效成分〔M〕.第1版.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，1997:119-120.