張董燕 季海峰 王四新 王 晶 劉 輝 王雅民

(北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097)

對(duì)于生長(zhǎng)豬，其飼養(yǎng)目標(biāo)是保證較高的生長(zhǎng)速度及飼料轉(zhuǎn)化效率，以獲得最佳的經(jīng)濟(jì)效益。一直以來(lái)，養(yǎng)殖者們往往選用抗生素作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑用于養(yǎng)豬生產(chǎn)中，但長(zhǎng)期大量使用會(huì)導(dǎo)致其在豬體組織及器官內(nèi)蓄積，造成豬肉產(chǎn)品的藥物殘留，或者代謝不完全經(jīng)糞便排出體外使得養(yǎng)殖環(huán)境趨于惡化。因此，減少或替代抗生素在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的使用直接關(guān)系到畜產(chǎn)品及人類生活的安全。研究認(rèn)為，乳酸菌是人和動(dòng)物胃腸道的正常菌群，該類菌群能夠調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道菌群平衡，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，抑制腸道內(nèi)病原菌的生長(zhǎng)和繁殖，從而對(duì)機(jī)體起到益生作用［1-2］。Timmerman等［3］指出，同源性乳酸菌對(duì)宿主的益生作用優(yōu)于異源性菌群，即理想的菌株應(yīng)該來(lái)自同種動(dòng)物的消化道。同時(shí)，同源乳酸菌作為益生菌株還應(yīng)具有較高的定植黏附能力，以及耐酸、耐膽汁鹽及抑菌等優(yōu)良性能［4］。因此，菌種是影響飼用乳酸菌發(fā)揮益生作用的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)室從生長(zhǎng)育肥豬糞便中分離篩選得到1株乳酸菌，經(jīng)鑒定為唾液乳桿菌(L.salivarius)，本試驗(yàn)擬將該菌株應(yīng)用于生長(zhǎng)豬飼糧中，通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)研究該菌株對(duì)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能、糞中微生物數(shù)量及血清指標(biāo)的影響，從而為該菌株在生長(zhǎng)豬養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

試驗(yàn)用豬源L.salivarius分離自60 kg生長(zhǎng)育肥豬糞便，經(jīng)中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心鑒定為L(zhǎng).salivarius，其凍干制劑中活菌數(shù)≥3.5×109CFU/g，由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究室保存。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及飼糧

試驗(yàn)動(dòng)物選用長(zhǎng)×大二元雜交生長(zhǎng)豬，基礎(chǔ)飼糧參照我國(guó)《豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 65—2004)配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

選用81頭平均體重為(35.22±0.86)kg的長(zhǎng)×大二元雜交生長(zhǎng)豬，隨機(jī)分成3組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)9頭。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加0.2%、0.4%(每克飼糧活菌數(shù)分別為7.0×106和1.4×107CFU)的L.salivarius凍干制劑的試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)期為30 d。試驗(yàn)在封閉式豬舍內(nèi)進(jìn)行，水泥地面圈養(yǎng)，自由采食，以鴨嘴式飲水器提供充足清潔飲水，免疫、驅(qū)蟲(chóng)和消毒按豬場(chǎng)常規(guī)飼養(yǎng)管理規(guī)程進(jìn)行。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 生長(zhǎng)性能測(cè)定

正式試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)，個(gè)體空腹稱重，統(tǒng)計(jì)耗料量，計(jì)算平均日增重、平均日采食量和料重比。

1.4.2 糞中微生物數(shù)量測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取6頭生長(zhǎng)豬進(jìn)行新鮮糞樣采集，盛于無(wú)菌鋁盒中，立即放入-20℃冰箱保存待測(cè)。實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法檢測(cè)糞中大腸桿菌和乳酸菌數(shù)量，以lg(CFU/g)表示。

1.4.3 血清指標(biāo)測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每組隨機(jī)挑選6頭生長(zhǎng)豬(每個(gè)重復(fù)2頭)，前腔靜脈采血5 mL，分離血清后于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。血清總膽固?TCHO)、甘油三酯(TG)含量以及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性在HITACHI 7020自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定，試劑盒均購(gòu)于中生北控生物科技股份有限公司;血清結(jié)合珠蛋白(Hp)含量采用豬結(jié)合珠蛋白酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(美國(guó)Immunology Consunltants公司生產(chǎn))測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中的one-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 生長(zhǎng)性能

由表2可知，飼糧中添加0.2%、0.4%的豬源L.salivarius后生長(zhǎng)豬的平均日增重均有升高趨勢(shì)，但差異不顯著(P＞0.05);與對(duì)照組相比，2個(gè)試驗(yàn)組生長(zhǎng)豬的平均日采食量和料重比無(wú)顯著變化(P＞0.05)。

表2 豬源L.salivarius對(duì)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能的影響Table 2 Effects of L.salivarius from pigs on growth performance of growing pigs

2.2 糞中微生物數(shù)量

由表3可知，飼糧中添加0.2%和0.4%的豬源L.salivarius后均能夠顯著增加生長(zhǎng)豬糞中乳酸菌數(shù)量(P＜0.05)，并顯著降低大腸桿菌數(shù)量(P＜0.05)。此外，飼糧中添加0.2%和0.4%的豬源L.salivarius后還能夠顯著提高乳酸菌與大腸桿菌的比值(P＜0.05)。上述指標(biāo)2個(gè)試驗(yàn)組間均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

表3 豬源L.salivarius對(duì)生長(zhǎng)豬糞中微生物數(shù)量的影響Table 3 Effects of L.salivarius from pigs on the number of faecal microflora of growing pigs lg(CFU/g)

2.3 血清指標(biāo)

2.3.1 血清生化指標(biāo)

由表4可知，飼糧添加0.2%和0.4%的豬源L.salivarius后生長(zhǎng)豬血清總膽固醇含量及谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著降低(P＜0.05)，而血清甘油三酯含量雖有下降趨勢(shì)，但差異不顯著(P＞0.05)。

表4 豬源L.salivarius對(duì)生長(zhǎng)豬血清生化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of L.salivarius from pigs on serum biochemical indices of growing pigs

2.3.2 血清結(jié)合珠蛋白含量

由表5可知，飼糧中添加0.2%和0.4%的豬源L.salivarius后生長(zhǎng)豬血清結(jié)合珠蛋白含量分別比對(duì)照組降低了20.18%、27.53%，均差異顯著(P＜0.05)，2個(gè)試驗(yàn)組間差異不顯著(P＞0.05)。

表5 豬源L.salivarius對(duì)生長(zhǎng)豬血清結(jié)合珠蛋白含量的影響Table 5 Effects of L.salivarius from pigs on serum Hp content of growing pigs mg/mL

3 討論

3.1 豬源L.salivarius對(duì)生長(zhǎng)豬生長(zhǎng)性能的影響

動(dòng)物消化道內(nèi)存在大量的有益微生物，這些微生物對(duì)宿主的營(yíng)養(yǎng)吸收起著重要的作用。Zoetendal等［5］指出，許多在動(dòng)物生長(zhǎng)方面具有促進(jìn)作用的試驗(yàn)研究大都是通過(guò)調(diào)控消化道微生物的途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Davis等［6］認(rèn)為，在飼糧中添加可直接飼喂的微生物(direct-fed microbials，DFM)，如乳酸菌，能夠直接改變動(dòng)物消化道的菌群組成。乳酸菌能夠通過(guò)產(chǎn)酸降低腸道pH，促進(jìn)蛋白酶等消化酶的分泌，從而有益于機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)［7-8］。Pluske［9］、Estienne等［10］均認(rèn)為，斷奶后2周是仔豬斷奶應(yīng)激適應(yīng)階段，是腸道菌群逐漸恢復(fù)完善的過(guò)程，此時(shí)使用乳酸菌效果最好，隨著消化道微生態(tài)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，斷奶后3～5周其益生效果則沒(méi)有剛斷奶時(shí)明顯［11］。當(dāng)豬群到達(dá)生長(zhǎng)階段后，機(jī)體消化系統(tǒng)較為完善，免疫力及對(duì)外界環(huán)境的抵抗能力均相對(duì)較強(qiáng)，益生菌的平均日增重提高效果雖要差于日齡較小的豬體，但其益生效果會(huì)在提高飼料轉(zhuǎn)化率和機(jī)體免疫力等方面表現(xiàn)出來(lái)［12］。另外，添加劑量是影響乳酸菌發(fā)揮益生作用的主要因素之一。Lee等［13］推薦動(dòng)物飼糧中乳酸菌的最低添加劑量為106CFU/g，大部分飼養(yǎng)試驗(yàn)是保證每只豬每天吃到109～1010CFU乳酸菌，即每克飼糧中應(yīng)添加106～107CFU活菌。除此之外，乳酸菌益生作用的發(fā)揮還要受到豬種、飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)密度及飼喂方式等諸多方面的影響。在本試驗(yàn)過(guò)程中，試驗(yàn)組分別添加0.2%、0.4%的豬源L.salivarius(每克飼糧中活菌數(shù)分別為7×106、1.4×107CFU)，隨著添加量的增加，生長(zhǎng)豬的平均日增重均有升高趨勢(shì)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該菌株的應(yīng)用潛力，下文對(duì)該菌株在豬群糞中微生物數(shù)量、血清指標(biāo)等方面進(jìn)行探討分析。

3.2 豬源L.salivarius對(duì)生長(zhǎng)豬糞中微生物數(shù)量的影響

大腸桿菌感染是引起豬群腹瀉的主要原因之一。乳酸菌和大腸桿菌被認(rèn)為是指示腸道健康的主要菌群［14］，消化道中乳酸菌與大腸桿菌的比值可作為檢測(cè)腸道菌群平衡的指示指標(biāo)［15］，乳酸菌數(shù)量高于大腸桿菌數(shù)量能夠促進(jìn)有益菌對(duì)腸道病原菌抑制作用的發(fā)揮［16］。侯璐［17］和 Mallo 等［18］對(duì)斷奶仔豬進(jìn)行的研究以及侯成立［19］對(duì)母豬進(jìn)行的研究均指出飼糧中添加乳酸菌能夠顯著增加回腸、盲腸及糞便中乳酸菌數(shù)量，降低其中大腸桿菌數(shù)量。Giang等［11］指出，乳酸菌能夠抑制病原菌生長(zhǎng)的主要原因是由于其能夠產(chǎn)生有機(jī)酸，使回腸、結(jié)腸中乳酸、乙酸含量升高，降低腸道pH，而大腸桿菌在pH低于5.5時(shí)難以生長(zhǎng)。

另外，豬排泄物中存在著大量未被消化吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，經(jīng)厭氧微生物發(fā)酵后生成惡臭氣體，嚴(yán)重污染環(huán)境。Zhu［20］指出，大腸桿菌中大部分菌株是產(chǎn)生吲哚惡臭物的主要微生物。因此，飼糧中通過(guò)添加乳桿菌可以抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)、繁殖，從而間接減少吲哚等惡臭物質(zhì)的排放。本試驗(yàn)中，飼糧中添加0.2%、0.4%的豬源L.salivarius均能夠顯著增加糞中乳酸菌數(shù)量，并顯著降低大腸桿菌數(shù)量，同時(shí)對(duì)乳酸菌與大腸桿菌的比值具有顯著的增加效應(yīng)，這說(shuō)明該菌株在改善生長(zhǎng)豬消化道菌群組成、促進(jìn)腸道健康、減少吲哚類惡臭物質(zhì)排放等方面具有積極的作用。

3.3 豬源L.salivarius對(duì)生長(zhǎng)豬血清指標(biāo)的影響

3.3.1 血清生化指標(biāo)

肝臟是機(jī)體重要的代謝場(chǎng)所，與脂類分解合成具有密切的關(guān)系。血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性是檢測(cè)肝功能的最敏感的2個(gè)指標(biāo)，這2種酶活性升高程度越高，表明肝細(xì)胞損傷程度越大。當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，會(huì)導(dǎo)致脂類代謝異常。本試驗(yàn)對(duì)生長(zhǎng)豬血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加0.2%和0.4%的豬源L.salivarius后生長(zhǎng)豬血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性均顯著降低，同時(shí)，生長(zhǎng)豬血清總膽固醇含量也顯著降低，血清中甘油三酯含量有下降趨勢(shì)，但差異不顯著。這說(shuō)明該菌株對(duì)保護(hù)肝臟、調(diào)控肝臟的脂類代謝具有積極的作用。Bongaerts等［21］分析認(rèn)為，乳酸菌活菌數(shù)達(dá)到一定濃度時(shí)能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)底物或產(chǎn)酸有效抑制其他致病菌的生長(zhǎng)、繁殖，減少肝臟損傷。血清總膽固醇和甘油三酯含量是反映體脂代謝的重要生化指標(biāo)，一些乳酸菌在生長(zhǎng)、繁殖過(guò)程中能夠產(chǎn)生膽鹽水解酶，具有膽鹽水解酶的菌體能將膽汁鹽解離成膽汁酸，肝臟需要重新合成膽汁鹽滿足體內(nèi)循環(huán)需要，因此使得肝臟需要膽固醇量增加，從而減少血清膽固醇含量。目前已報(bào)道的具有水解膽固醇效應(yīng)的菌株有嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)ATCC 314、嗜酸乳桿菌FTCC 0291、保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)FTCC 0411、保加利亞乳桿菌FTDC 1311、干酪乳桿菌(L.casei)ATCC 393等［22］，并將水解膽汁鹽效應(yīng)作為菌株去除膽汁鹽益生特性的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

3.3.2 血清結(jié)合珠蛋白含量

在生長(zhǎng)過(guò)程中，飼糧營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境、飼養(yǎng)條件等諸多因素都會(huì)影響豬群的健康。目前，國(guó)外主要通過(guò)測(cè)定豬群血清中結(jié)合珠蛋白和豬主要急性期蛋白(MAP)作為檢測(cè)豬群健康、亞健康及疾病等機(jī)體狀況的主要評(píng)定指標(biāo)。其中，結(jié)合珠蛋白主要由肝臟產(chǎn)生，主要存在于血清中，體液中也有少量存在，被認(rèn)為是檢測(cè)豬體內(nèi)急性期蛋白(APP)最具有敏感性和特異性且最為有效的指標(biāo)。Pineiro等［23］對(duì)10個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)的健康長(zhǎng)×大豬群進(jìn)行了血清結(jié)合珠蛋白含量檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哺乳仔豬血清結(jié)合珠蛋白含量最低，隨著日齡的增加，血清結(jié)合珠蛋白含量逐漸升高，到第12周時(shí)達(dá)到最高，而后趨于穩(wěn)定。Witten［24］研究得出，健康豬血清中結(jié)合珠蛋白含量為0.079～2.000 mg/mL;Le等［25］指出，血清結(jié)合珠蛋白含量隨著豬群品種、年齡、環(huán)境的變化而存在不同。當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥、感染、組織損傷及體內(nèi)失衡時(shí)，其損害程度越大，結(jié)合珠蛋白含量越高［26］。許美芳［27］通過(guò)研究也發(fā)現(xiàn)，血清結(jié)合珠蛋白含量與機(jī)體所受的刺激類型和強(qiáng)度有關(guān)，細(xì)菌感染后血清結(jié)合珠蛋白含量在48 h達(dá)到最大值，病毒感染后其含量在72 h達(dá)到最大值。本試驗(yàn)研究了豬源L.salivarius對(duì)生長(zhǎng)豬血清結(jié)合珠蛋白含量的影響，結(jié)果顯示，飼糧中添加0.2%和0.4%的豬源L.salivarius均能夠降低血清結(jié)合珠蛋白含量，分別比對(duì)照組降低了20.18%、27.53%，差異顯著。分析其原因主要是由于乳酸菌可以通過(guò)抑制病原菌生長(zhǎng)、繁殖，提高機(jī)體免疫力，減少炎癥、感染的發(fā)生率，從而減少對(duì)機(jī)體組織的損傷，最終使血清中結(jié)合珠蛋白的含量減少。

4 結(jié)論

綜合以上各項(xiàng)指標(biāo)，飼糧中添加豬源L.salivarius能夠改善生長(zhǎng)豬腸道菌群環(huán)境和血清指標(biāo)，提高機(jī)體免疫力，進(jìn)而促進(jìn)其生長(zhǎng)。

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