，，

(遼寧醫(yī)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州 121000)

副干酪乳酸菌L1產(chǎn)淀粉酶條件優(yōu)化及溫度、pH對淀粉酶酶活力的影響

孫竹萍，張莉力*，王玉田

(遼寧醫(yī)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州 121000)

從酸漿中分離得到的副干酪乳酸菌L1能夠與淀粉結(jié)合，產(chǎn)生淀粉酶，分解淀粉。本實驗研究不同培養(yǎng)條件對副干酪乳酸菌產(chǎn)淀粉酶量以及溫度、pH對淀粉酶活力的影響。通過單因素和正交實驗對產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：培養(yǎng)基初始pH為4.0、培養(yǎng)溫度為42℃、以6%馬鈴薯淀粉作為碳源、接種量為8%、培養(yǎng)96h時副干酪乳酸菌L1產(chǎn)淀粉酶量最高。副干酪乳酸菌L1產(chǎn)生的淀粉酶在酸性條件下具有較高活性，在pH4.0時淀粉酶活力最高，淀粉酶最適反應(yīng)溫度為40℃，在此條件下淀粉酶活力最高可達(dá)102.95U/mL。其中副干酪乳酸菌L1利用不經(jīng)過糊化淀粉比利用經(jīng)過糊化淀粉產(chǎn)淀粉酶量高，說明副干酪乳酸菌L1能利用生淀粉產(chǎn)淀粉酶。

副干酪乳酸菌L1，溫度，pH，淀粉酶

分解淀粉的乳酸菌是指能夠產(chǎn)生淀粉酶，從而分解淀粉的乳酸菌。這類乳酸菌可以直接利用淀粉產(chǎn)生乳酸，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的淀粉分解乳酸細(xì)菌主要是從淀粉質(zhì)原料(谷物和木薯)的發(fā)酵食品中分離得到的，包括：食淀粉乳桿菌，嗜淀粉乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、植物乳桿菌等[1]。張莉力[2]等從自然發(fā)酵的甘薯酸漿中，分離篩選得到一株能夠絮凝淀粉的菌株，經(jīng)鑒定為乳酸菌，并命名為副干酪乳酸菌L1。該菌株能夠特異性的結(jié)合到淀粉顆粒表面，產(chǎn)生淀粉酶，利用淀粉，使發(fā)酵液pH下降。Reddy[3]研究組研究了L.amylophilusGV6的淀粉酶活性，用嗜淀粉乳酸菌GV6發(fā)酵麥糠，研究GV6產(chǎn)生的直鏈淀粉酶和支鏈淀粉酶活力，研究表明在pH6.5，溫度37℃時淀粉酶活性最大，直鏈淀粉酶和支鏈淀粉酶的活性分別為0.439U/(g·min)和0.18U/(g·min)。Basa Janakiram Naveena[4]研究L.amylophilusGV6在生的小麥淀粉作碳源的半固體培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)淀粉酶，在pH6.5，溫度37℃發(fā)酵130h，產(chǎn)生淀粉酶最多。乳酸是一種應(yīng)用非常廣泛的有機酸，傳統(tǒng)乳酸生產(chǎn)方法稱為兩步法，首先用淀粉酶將淀粉水解成葡萄糖，再利用乳酸菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乳酸。隨著乳酸使用量的增大，傳統(tǒng)的兩步法生產(chǎn)乳酸因成本較高且工藝復(fù)雜，逐漸不能滿足市場的供應(yīng)。所以國內(nèi)外學(xué)者開始研究一步法生產(chǎn)乳酸，即將淀粉酶水解和葡萄糖發(fā)酵耦合。在一步法發(fā)酵乳酸過程中，淀粉酶活力是一個重要的指標(biāo)。由于一步法發(fā)酵乳酸的研究比較少，只有國外的研究者針對嗜淀粉乳酸菌進(jìn)行了研究，本文對副干酪乳酸菌L1菌株產(chǎn)淀粉酶的條件優(yōu)化以及酶活與pH、溫度的關(guān)系進(jìn)行研究，為一步法發(fā)酵乳酸提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

副干酪乳酸菌L1 遼寧醫(yī)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實驗室提供；改良TJA培養(yǎng)基 番茄汁50mL，酵母浸出物5g，牛肉膏10g，乳糖20g，可溶性淀粉2g，K2HPO42g，吐溫80 1g，乙酸鈉5g，水加至1000mL,pH6.00±0.20；淀粉培養(yǎng)基 可溶性淀粉1g,蛋白胨1g，葡萄糖0.5g，NaCl 0.5g，牛肉膏0.5g，瓊脂粉0.8g；產(chǎn)酶培養(yǎng)基 將改良TJA培養(yǎng)基中的乳糖換為馬鈴薯淀粉，發(fā)酵過程中加入少量CaCO3。

高壓滅菌鍋 BKFI-HJK型北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司；電子分析天平M4-AL204型 蘭州中西儀器；恒溫培養(yǎng)箱DHP-9082型 金壇市鑫鑫實驗儀器廠；水浴鍋DK-98-l型 天津泰斯特儀器公司；超凈工作臺JB-VS-1300型 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；pH測定計DHP-9052型 上海一恒科技有限公司；數(shù)碼生物顯微鏡 ME2I OLYMPUS；722可見光分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2發(fā)酵方法

將副干酪乳酸菌L1由試管斜面接種于TJA培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，35℃培養(yǎng)48h，至菌體密度為108個/mL。

1.3產(chǎn)酶初檢

將活化的副干酪乳酸菌L1用滴種法接種在淀粉培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)48h,采用碘液染色[5]，若在菌落周圍有透明圈產(chǎn)生，證明副干酪乳酸菌L1能夠產(chǎn)淀粉酶。

1.4淀粉酶活力測定

1.4.1 粗酶液的制取 將活化的菌按7%的接種量接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)。離心5000r/min,15min,收集上清液，為待測粗酶液。

1.4.2 酶活測定方法[6]1%底物溶液：稱取馬鈴薯淀粉1.0g，用25mL 0.4mol/L的NaOH溶液溶解，在沸水浴中加熱10min，待其冷卻后加入25mL 0.4mol/L的CH3COOH溶液，調(diào)節(jié)pH至7.0，然后定容在100mL容量瓶中。

取10mL底物溶液于試管中，40℃水浴預(yù)熱10min后，取1mL發(fā)酵液加入其中，搖勻，然后40℃精確保溫10min。吸取1mL于盛有10mL 0.1mol/L HCl的試管中，再取0.5mL混合液于盛有10mL 0.005%碘液的試管中，搖勻，并立即用分光光度計測其在660nm處吸光度。用同樣方法測定空白值D0，用以1.0mL的不含菌的培養(yǎng)基代替發(fā)酵液，其余步驟同上。用蒸餾水作為參比。

酶活定義：將淀粉酶單位定義為在上述測定條件下，反應(yīng)1min使1%馬鈴薯淀粉溶液的顯藍(lán)強度降低1%所需的酶量為1個單位。

酶活=(D0-D)×100×發(fā)酵液稀釋倍數(shù)/(D0×10)

式中，D0為空白值吸光度，D為樣品吸光度，100為系數(shù)(%)，10為反應(yīng)時間(min)。每個單因素實驗中，以酶活最高值為100%，計算相對酶活。

1.5單因素實驗

1.5.1 培養(yǎng)基pH對菌株產(chǎn)淀粉酶的影響 以不同pH的緩沖溶液配制pH分別為2、3、4、5、6、7、8、9、10產(chǎn)酶培養(yǎng)基，115℃滅菌15min，冷卻后按7%接種量接種后，放在40℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h后，取樣測定淀粉酶活力。

1.5.2 培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)淀粉酶的影響 將以滅菌含有等量產(chǎn)酶培養(yǎng)基的三角瓶按7%的接種量接種后，放在溫度分別為35、40、45、50℃的條件下培養(yǎng)96h后，取樣測定淀粉酶活力。

1.5.3 不同碳源及是否糊化對菌株產(chǎn)淀粉酶的影響 分別用可溶性淀粉、玉米淀粉、甘薯淀粉、馬鈴薯淀粉作為碳源配制產(chǎn)酶培養(yǎng)基，分裝于三角瓶中滅菌，冷卻后，按7%的接種量接種，放在40℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h，取樣測定淀粉酶活力。稱取不同種類淀粉于105℃的干燥培養(yǎng)箱中滅菌24h后,在無菌條件下加入到不含碳源的已滅菌的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，按7%的接種量接種后，放在40℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h后，取樣測定淀粉酶活力。

1.5.4 含碳量對菌株產(chǎn)淀粉酶的影響 稱取不同質(zhì)量的馬鈴薯淀粉配制成淀粉含量分別為1%、2%、4%、6%、8%的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，分裝于三角瓶中滅菌，冷卻后，按7%的接種量接種，放在40℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h后,取樣測定淀粉酶活力。

1.5.5 接種量對菌株產(chǎn)淀粉酶的影響 將以滅菌含有等量產(chǎn)酶培養(yǎng)基的三角瓶，按5%、7%、9%、11%接種量接種后，放在40℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h,取樣測定淀粉酶活力。

1.5.6 培養(yǎng)時間與菌株產(chǎn)淀粉酶的關(guān)系 將以滅菌含有等量產(chǎn)酶培養(yǎng)基的三角瓶按7%的接種量接種后，放在40℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24h取樣測淀粉酶活力。

1.6產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取溫度、pH、接種量，進(jìn)行正交實驗。選取溫度分別為37、40、42、45℃，pH分別3.5、4.0、4.5、5.0，接種量分別為6.0%、7.0%、8.0%、9.0%，以副干酪乳酸菌L1產(chǎn)淀粉酶活力為指標(biāo)，確定產(chǎn)酶量最高時的溫度、pH以及接種量(v/v)。

表1 L16(4×3)正交實驗因素水平表

1.7酶學(xué)性質(zhì)的研究

1.7.1 最適反應(yīng)溫度 將粗酶液于不同溫度下測其淀粉酶活力，將淀粉酶活力最高的定義為相對酶活100%。

1.7.2 最適反應(yīng)pH 用1mol/L鹽酸和1mol/L NaOH調(diào)節(jié)粗酶液的pH，測不同pH條件下淀粉酶活力。

1.8數(shù)據(jù)分析

每個條件做3個平行樣，每個樣品測定3次，取平均值。用SPSS13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Excel 2003作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1副干酪乳酸菌L1產(chǎn)淀粉酶初檢

由圖1可知經(jīng)碘液染色法初檢，副干酪乳酸菌L1菌落周圍有透明圈產(chǎn)生，說明副干酪乳酸菌L1能產(chǎn)生淀粉酶分解淀粉。

圖1 碘液染色初檢

2.2單因素實驗結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)基pH對菌株產(chǎn)淀粉酶的影響 由圖2可知，副干酪乳酸菌L1在不同pH條件下都能產(chǎn)淀粉酶，產(chǎn)酶量較高集中在pH為3.0、4.0、5.0。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為4.0時相對酶活為100%，其次為pH為3.0時，相對酶活為85.41%。當(dāng)pH為10.0時產(chǎn)酶量最低，相對酶活為15.26%。當(dāng)初始培養(yǎng)基pH大于6.0時，隨pH變大，酶活迅速降低。培養(yǎng)基pH對副干酪乳酸菌L1產(chǎn)淀粉酶的影響呈現(xiàn)單峰現(xiàn)象，大多數(shù)文獻(xiàn)記載微生物發(fā)酵無論產(chǎn)生酸性、中性還是堿性淀粉酶，培養(yǎng)基的初始pH與微生物產(chǎn)淀粉酶的量都呈單峰型[7-8]。副干酪乳酸菌L1在pH4.0時產(chǎn)酶量達(dá)到峰值。

圖2 培養(yǎng)基初始pH對L1菌株產(chǎn)淀粉酶的影響

2.2.2 培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)淀粉酶的影響 由圖3可知，副干酪乳酸菌L1菌株在不同培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)，低于40℃時，隨溫度升高產(chǎn)酶量升高，以40℃相對酶活為100%，高于40℃溫度，產(chǎn)酶量下降。35℃的相對酶活比40℃低28.8%，差異極顯著(p<0.01)。

圖3 培養(yǎng)溫度對L1菌株產(chǎn)淀粉酶的影響

2.2.3 不同碳源及是否糊化對菌株產(chǎn)淀粉酶的影響 由圖4可知，當(dāng)?shù)矸郾缓瘯r，以甘薯淀粉為碳源，副干酪乳酸菌L1產(chǎn)酶量最高，可溶性淀粉，玉米淀粉，馬鈴薯淀粉都可作為有效碳源刺激副干酪乳酸菌L1產(chǎn)淀粉酶，馬鈴薯淀粉作為碳源產(chǎn)酶量最低。當(dāng)?shù)矸鄄槐缓?，以馬鈴薯淀粉為碳源產(chǎn)酶量最高，酶活為69.56U/mL，其次是甘薯淀粉、可溶性淀粉、玉米淀粉。結(jié)果表明：除可溶性淀粉外，同一種類淀粉未糊化比淀粉糊化酶活高，證明了副干酪乳酸菌L1能利用生淀粉產(chǎn)淀粉酶。選擇馬鈴薯淀粉作為碳源，副干酪乳酸菌L1產(chǎn)酶量最高。

圖4 淀粉種類和糊化度對L1菌株產(chǎn)淀粉酶的影響

2.2.4 淀粉含量對菌株產(chǎn)淀粉酶的影響 以馬鈴薯淀粉作為碳源，不同淀粉含量對副干酪乳酸菌L1產(chǎn)淀粉酶量的影響如圖5所示。隨淀粉含量升高，副干酪乳酸菌L1產(chǎn)淀粉酶量升高，當(dāng)?shù)矸厶砑恿繛?%時，測得相對酶活為100%，當(dāng)?shù)矸酆砍^6%時，產(chǎn)酶量降低，淀粉含量8%時，相對酶活為76.55%。結(jié)果證明：較高的淀粉含量不但不會促進(jìn)副干酪乳酸菌L1菌產(chǎn)淀粉酶，反而抑制L1產(chǎn)淀粉酶，這可能是由于菌利用淀粉的效率被積累的糊精所限制，因而不能進(jìn)一步發(fā)酵，因此菌的生長和淀粉酶的合成受到限制[9]。

圖5 淀粉含量對L1菌株產(chǎn)淀粉酶的影響

2.2.5 接種量v/v對菌株產(chǎn)淀粉酶的影響 由圖6可知，當(dāng)接種量7%為時，副干酪乳酸菌L1產(chǎn)淀粉酶相對酶活為100%。當(dāng)接種量超過7%，隨接種量的升高，相對酶活下降。結(jié)果證明：較大接種量可以縮短微生物前期的發(fā)酵時間，但是如果接種量過大則會引起菌絲的大量繁殖，使菌生長所需的養(yǎng)料和氧氣不足，干擾菌的正常代謝[10]。也可能因為菌絲生長過快產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物過多從而影響產(chǎn)淀粉酶。接種量過低，則發(fā)酵時，菌株生長需較長時間才能進(jìn)入平穩(wěn)期，所以發(fā)酵培養(yǎng)96h淀粉酶的累積不能達(dá)到最大值。

圖6 接種量對L1菌株產(chǎn)淀粉酶的影響

2.2.6 培養(yǎng)時間與菌株產(chǎn)淀粉酶的關(guān)系 由圖7可知，副干酪乳酸菌L1在40℃培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)96h，淀粉酶活力為98.78U/mL，淀粉酶相對酶活100%，培養(yǎng)超過96h，隨培養(yǎng)時間淀粉酶活力降低。培養(yǎng)到72h時，酶活略有下降，發(fā)酵液的pH由6.00下降到4.34，可能是發(fā)酵液pH下降，抑制了淀粉酶活力，而發(fā)酵到96h，由于CaCO3的加入中和掉一部分酸，使發(fā)酵液pH升高，淀粉酶活力增加。研究發(fā)現(xiàn)其他分解淀粉的乳酸菌[11-12]的產(chǎn)酶活力范圍在6～21U/mL，副干酪乳酸菌L1產(chǎn)淀粉酶活力明顯高于其他菌株。

圖7 培養(yǎng)時間對L1菌株產(chǎn)淀粉酶的影響

2.3正交實驗結(jié)果分析

為了優(yōu)化副干酪乳酸菌L1產(chǎn)淀粉酶的培養(yǎng)條件，根據(jù)表1進(jìn)行正交實驗。測定不同處理組L1產(chǎn)淀粉酶活力，結(jié)果如表2所示。比較三種因素的R值大小可知，RA>RC>RB，即培養(yǎng)溫度是主要因素，其次是接種量，pH對L1產(chǎn)淀粉酶影響最小。由極差分析結(jié)果得出最優(yōu)條件為，A3B2C3即溫度42℃，pH4.0，接種量8%。并由此條件培養(yǎng)副干酪乳酸菌L1測淀粉酶活力為102.95U/mL。為確定各因素對實驗結(jié)果的影響，對正交實驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4所示：溫度、接種量對產(chǎn)淀粉酶量的影響顯著(p<0.05)。pH對副干酪乳酸菌L1產(chǎn)淀粉酶量的影響不顯著(p>0.05)。

表2 不同條件下酶活正交實驗結(jié)果

表3 主效應(yīng)的方差分析

注：R2=0.867(調(diào)整后R2=0.667)；p<0.05，差異顯著。

2.4酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 溫度對淀粉酶活力的影響 以pH7的緩沖溶液配制的副干酪乳酸菌L1產(chǎn)淀粉酶的粗酶液，在不同溫度下測淀粉酶活力，結(jié)果如圖8所示：溫度在30～40℃時，副干酪乳酸菌L1產(chǎn)生的淀粉酶活力隨溫度升高而升高，40℃淀粉酶相對酶活達(dá)到100%，溫度超過40℃隨溫度升高，淀粉酶活力下降，45℃相對酶活為97.51%，差異性不顯著(p<0.01)。30℃和50℃時相對酶活較低，分別為39.01%，53.09%。結(jié)果表明：副干酪乳酸菌L1產(chǎn)生的淀粉酶為中性淀粉酶，高溫會使酶活降低。Penka Petrova[13]在實驗中測得副干酪乳桿菌B41淀粉酶活力在45℃最高，37℃時相對酶活為83.33%，高于56℃相對酶活降到61.67%。M. Hujanen[14]研究干酪乳桿菌NRRL B-441產(chǎn)淀粉酶最適溫度為35℃。

圖8 反應(yīng)溫度對淀粉酶活力的影響

2.4.2 pH對淀粉酶活力的影響 不同pH粗酶液測得淀粉酶活力，如圖9所示：在pH為4.0時淀粉酶相對酶活為100%，當(dāng)pH高于4.0時淀粉酶活力下降，當(dāng)pH為10.0時淀粉酶活力最低，相對酶活為32.34%。副干酪乳酸菌L1產(chǎn)生的淀粉酶活性在酸性條件下較高，pH為3.0時相對酶活為88.34%，與pH4時差異性極顯著(p<0.01)。結(jié)果表明：副干酪乳酸菌L1產(chǎn)生的淀粉酶在酸性條件下酶活力較好。多數(shù)文獻(xiàn)報道微生物產(chǎn)淀粉酶也多為酸性淀粉酶，最適pH4.0～5.0[15-16]，陳波等[17]分離得到產(chǎn)酸性α-淀粉酶的菌株，該淀粉酶最適pH為4.4，pH大于7，淀粉酶活力迅速降低，與本實驗測得結(jié)果基本相同。

圖9 反應(yīng)pH對淀粉酶活力的影響

3 結(jié)論

副干酪乳酸菌L1在改良TJA培養(yǎng)基中，淀粉作為唯一碳源，發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶。產(chǎn)淀粉酶最佳條件為發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH4.0，淀粉含量6%，以濃度為108個/mL菌懸液接種，接種量為8%，42℃條件下培養(yǎng)，96h產(chǎn)酶量最大，淀粉酶活性最高為102.95U/mL。

副干酪乳酸菌L1產(chǎn)生的淀粉酶為低溫淀粉酶，酶活最適反應(yīng)溫度為40℃，L1產(chǎn)生的淀粉酶不耐高溫，可能因為產(chǎn)生的β-淀粉酶較多。淀粉酶反應(yīng)最適pH為4.0，屬于酸性淀粉酶。

副干酪乳酸菌L1能產(chǎn)生淀粉酶，分解利用淀粉，產(chǎn)生還原糖，為分解淀粉乳酸細(xì)菌(Amylolyticlactic acid bacteria，ALAB)發(fā)酵一步法發(fā)酵產(chǎn)乳酸提供可能性。研究發(fā)現(xiàn)L.amylophilusGV6是最有潛力利用淀粉質(zhì)原料一步法發(fā)酵乳酸的菌。C.Vishnu[18]計算L.amylophilusGV6在以甘薯淀粉為碳源的液態(tài)培養(yǎng)基中產(chǎn)生胞外淀粉水解酶，包括直鏈淀粉酶和支鏈淀粉酶，直鏈淀粉酶和支鏈淀粉酶的活性分別為0.59U/(g·min)和340U/(mL·min)，最高酶活時溫度為37℃，pH6.5。與L.amylophilusGV6相比，副干酪乳酸菌L1有較高的產(chǎn)淀粉酶酶活力，所以該菌株可能會利用淀粉一步發(fā)酵產(chǎn)乳酸。

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Amylase fromLactobacillusparacaseiL1:Optimization of its fermentation condition and reaction temperature and pH

SUNZhu-ping，ZHANGLi-li*，WANGYu-tian

(Food Science and Engineering College,Liaoning Medical University,Jinzhou 121000,China)

LactobacillusparacaseiL1 which isolated from the sweet potato acid steeping liquor could combine with the starch to produce amylase and resolve the starch. This experiment was to study the effect of different culture condition on the production of amylase and the effect of temperature and pH to the activity of amylase. Through single factor and orthogonal experiments,the condition of enzyme production was optimized. The results showed that theLactobacillusparacaseiL1 could produce the highest amount of amylase when the initial culture medium pH was 4.0,culture temperature was 42℃,6% of potato starch was taken as carbon resource and when it was cultured 96h. The amylase produced byLactobacillusparacasiL1 has relevant high activity under acidic conditions. The amylase activity was highest when the pH was 4.0,and the optimum reaction temperature for the amylase was 40℃.Under this conditions,the highest activity of amylase could reach 102.95U/mL.LactobacillusparacaseiL1 which used starch without gelatinizing could produce more amylase than which of using starch with gelatinizing. That meansLactobacillusparacaseiL1 could use raw starch to produce amylase.

LactobacillusparacaseiL1；temperature；pH；amylase activity

2013-06-14 *通訊聯(lián)系人

孫竹萍(1988-)，女，碩士，研究方向:食品微生物。

國家自然科學(xué)基金項目(31301499)；遼寧醫(yī)學(xué)院博士教師科研啟動基金項目(2011B11)。

TS201.3

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