張良勝等

[摘要] 目的 探索成年SD大鼠糖尿病心肌?。―CM）模型建立的方法。 方法 20只健康SD成年大鼠作隨機分為DCM組（n=10）、對照組（n=10）。對照組喂養(yǎng)普通飼料，DCM組高脂飼料喂養(yǎng)12周。DCM模型的建立：對照組以枸櫞酸緩沖液腹腔注射，DCM組使用等量1%鏈脲菌素腹腔注射。通過病理組織學證實為DCM心肌病理學改變。 結果 與對照組比較，DCM組的血清FBG、TC、LDL-C、TG均明顯增高（P<0.05），而對照組的血清HDL-C較DCM組高（P<0.05）。與對照組比較，DCM組的大鼠心肌細胞排列紊亂，間質基質集聚與纖維化增多。第6周末，兩組的空腹血糖差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），DCM組的IRI、胰島素均高于對照組（P<0.05）。 結論 高脂、高糖膳食并小劑量STZ腹腔注射建立DCM模型，其方法成功率高，簡單易行。

[關鍵詞] 糖尿病心肌??；SD大鼠模型；鏈脲菌素

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）08（b）-0007-04

[Abstract] Objective To explore the method how to establish of adult Spprague-dawley rat model of diabetic cardiomyopathy （DCM）. Methods 20 healthy adult Spprague-dawley rats were randomly divided into the DCM group （n=10） and the control group （n=10）.Rats in the control group and DCM group was respectively fed with normal rat diet and high fat diet persistently 12 weeks.STZ was applied in the DCM group to make the rat DCM model by intraperitoneal injection，and the same dosage of citric acid buffer were used to the the control group by the same way.The myocardial pathological alteration of DCM was identified in the DCM group by histopathology. Results Compared with the control group，fasting blood glucose（FBG），low-density lipoprotein cholesterol （LDL-C），the serum total cholesterol （TC），and triglyeride （TG） of rats in the DCM group were higher （P<0.05），the serum High-density lipoprotein cholesterol （HDL-C） in the control group was higer than that in the DCM group （P<0.05）.Compared with the control group，rat myocardial cells of the DCM group arranged in disorder，interstitial matrix accumulation and fibrosis increased.At the end of 6th week，there was no statistical difference of fasting blood glucose in the two groups （P>0.05），but insulin and insulin resistance index in the DDM group were higher （P<0.05）. Conclusion Establishment of DCM model by intraperitoneal injection of small dose of Streptozotocin was easily with high-fat and hige-sugar diet.The method has high successful rate，and it is simple and easy.

[Key words] Diabetic cardiomyopathy；Spprague-dawley rat model；Streptozotocin

近年來，中國糖尿病的發(fā)病率迅速上升，糖尿病前期患者高達1.48億，糖尿病患者達9240萬，防控形勢嚴峻[1]。目前認為，糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）較易導致嚴重心律失常和心力衰竭，是一種特異性心肌病。Hamby等在1974年首次提出DCM的概念，指由糖尿病引起肌代謝紊亂，心肌纖維化和心臟微血管病變等所致的心肌廣泛結構異常，引起左心室肥大、舒張期和（或）收縮期功能障礙的一種疾病[2]，本實驗通過探索DCM模型建立的方法，為研究其發(fā)病機制及防治措施提供可靠的實驗理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

胰島素檢測試劑盒及鏈脲菌素（streptozotocin，STZ）購于美國Sigma公司；枸櫞酸，枸櫞酸三鈉購于北京化學試劑出品廠；葡萄糖試劑盒由上海榮盛生物科技公司提供；血脂檢測盒由南京建成生物研究所提供。

1.2 主要儀器

超低溫冰箱（MDF-382E，SANYO，Japan）；Millipore超純水儀（Elix3/Mini-QBicel， Millipore，USA）；微量移液器（1000 μl/100 μl/10 μl，Eppendorf公司）；低速離心機（Centrifuge 5702，Eppendorf，Germany）；全自動生化分析儀（Hitach-7060，日立公司，Japan）；體視顯微鏡（S8APO， LEICA，Germany）；光學攝像系統(tǒng)（AX-70型，Olympus，Japan）；超聲震蕩器（JG-4301，天津精工醫(yī)療設備公司，China）。

1.3造模方法

按照董世芬等[3-4]報道的方法建立DCM模型。將20只健康SD大鼠隨機分成DCM組（n=10），對照組（n=10），DCM組以高脂飲食喂養(yǎng)（59.5%基礎飼料，0.5%膽固醇，10%蛋黃粉，10%豬油和20%蔗糖），對照組始終以普通飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)至第6周，DCM組以1% STZ 30 mg/kg腹腔注射，對照組以同體積枸櫞酸緩沖液腹腔注射。72 h后取尾靜脈血測量空腹血糖，血糖≥11.1 mmol/L判定為2型糖尿病。造模結束后，對照組普通飼料喂養(yǎng)6周，DCM組高脂、高糖喂養(yǎng)6周。

1.4 SD大鼠左心室心肌病理切片制作

1.4.1 心室心肌HE染色 SD大鼠斷頸處死，快速取出心臟，以10%甲醛固定24 h，用硬蠟包埋。切片厚度4 μm，連續(xù)切片。蘇木素染色6～16 min，經水沖洗，酒精鹽酸分化。分化水洗以后，用溫水藍化后，流水沖洗6 min以上，伊紅復染（5～20 s）。低濃度乙醇到高濃度乙醇切片脫水，80%乙醇1次（3～5 min/次），95%乙醇2次（3～5 min/次），100%乙醇2次（10 min/次），二甲苯2次，樹膠封片。

1.4.2 左心室心肌病變的觀察 在BX60型光學顯微鏡下，放大100、200、400倍分別觀察HE染色左心室心肌病變。

1.5 血脂、血糖水平測定

全自動生化分析儀Hitach-7060測定血脂水平，包括LDL-C、HDL-C、TC、TG。TC、TG和BG采用常規(guī)酶法，HDL-C和LDL-C采用直接法。

1.6 大鼠胰島素、胰島素抵抗指數(shù)的測定

用Sigma公司的胰島素試劑盒測定胰島素，胰島素抵抗指數(shù)（insulin resistance index，IRI）等相關指標。

1.7 統(tǒng)計學處理

利用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DCM模型的建立

DCM組高脂飼料喂養(yǎng)6周后，兩組的空腹血糖差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但DCM組的IRI、胰島素均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表1）。第7周時給予STZ腹腔注射，3 d后測空腹血糖，1只未達標；3 d后給予腹腔補注射STZ后，測尾部空腹血糖>11.1 mmol/L，喂養(yǎng)12周，大鼠無死亡，成功率為100%。對照組用等量枸櫞酸緩沖液腹腔注射作為對照，血糖均正常，12周時無死亡。

2.2 DCM的血糖、血脂評價

與對照組比較，第12周時，DCM組的血清FBG、TG、TC、LDL-C均明顯增高，HDL-C低于對照組（P<0.05）（表2）。

膳食誘導0周時，高脂、高糖飲食6周后，兩組的空腹血糖差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），DCM組腹腔注射STZ并繼續(xù)高脂、高糖飲食至12周后，DCM組的血糖水平高于對照組（P<0.05）（表3）。

2.3 病理切片結果觀察

兩組隨機各抽取兩只大鼠作病理，結果可見：對照組的心肌纖維排列整齊，細胞間隙正常，胞質豐富，可見橫紋（圖1）。DCM組的心肌細胞排列紊亂，形態(tài)扭曲，呈空泡狀，部分心肌纖維壞死，斷裂，纖維組織替代壞死心肌，符合DCM心肌病理變化（圖2）。

3 討論

近年來，糖尿病的患病率迅速增高，在發(fā)展中國家，糖尿病已發(fā)展成為臨床的主要代謝性疾病，其導致的心血管并發(fā)癥嚴重威脅人們的健康[5]。Hamby等在1974年首次提出DCM的概念，指由糖尿病引起肌代謝紊亂，心肌纖維化和心臟微血管病變等所致的心肌廣泛結構異常，引起左心室肥大、舒張期和（或）收縮期功能障礙的一種疾病 。迄今的研究證據(jù)表明，有一部分糖尿病患者出現(xiàn)心力衰竭由DCM所致[2，6-7]，DCM的發(fā)病機制復雜，目前尚無特效治療。本實驗旨在探索DCM模型建立的方法，為研究其發(fā)病機制提供及防治措施提供可靠的實驗理論依據(jù)。

SD大鼠容易飼養(yǎng)，疾病抵抗力強，經濟實惠，容易獲得，是常用的實驗動物。本實驗以SD大鼠為研究對象建立DCM模型。建立DCM模型的方法主要有以下幾種。①1型糖尿病模型的建立：禁食12 h，大鼠一次性腹腔注射STZ（60 mg/kg），72 h后隨機血糖≥16.67 mmol/L判定為模型大鼠[8]；②2型糖尿病模型的建立：大鼠適應1周后，高糖、高脂飲食4～6周，禁食12 h后，給予腹腔注射STZ 30 mg/kg，3 d后隨機血糖≥16.67 mmol/L或者空腹血糖≥11.1 mmol/L判定為為造模成功[3，9]。國外文獻報道還有2種2型糖尿病模型建立方法。①轉基因小鼠：如zucker糖尿病肥胖小鼠，ob/ob肥胖小鼠，db/db糖尿病小鼠等[10-12]；②單純高脂飼料喂養(yǎng)建立模型：脂喂養(yǎng)C57BC/6小鼠，可出現(xiàn)代謝障礙及心功能障礙，直到20周后才出現(xiàn)血糖升高，建模周期較長，并且與糖尿病狀態(tài)有些差異[13-14]。單純高脂、高糖喂養(yǎng)模型不能成功，轉基因小鼠實驗條件要求高，價格昂貴，本實驗采用高糖、高脂喂養(yǎng)后，小劑量STZ腹腔注射成功建立DCM模型。2型糖尿病以代謝紊亂和胰島素抵抗為特征[15]。代謝紊亂主要包括：高血糖與脂肪酸升高。本實驗結果顯示，膳食誘導0周時，兩組的空腹血糖差異無統(tǒng)計學意義，高脂、高糖飲食6周后，兩組的空腹血糖差異無統(tǒng)計學意義，但DCM組的IRI、胰島素較對照組明顯升高，造成了胰島素抵抗。DCM組小劑量腹腔注射STZ后，3 d后血糖開始升高，形成糖尿病狀態(tài)，高糖、高脂繼續(xù)喂養(yǎng)到12周，血糖升高明顯。第12周DCM組的血清TG、TC、LDL-C均明顯增高，HDL-C低于對照組。以上結果表明，高糖、高脂膳食可造成大鼠胰島素抵抗，脂代謝紊亂，但是不能使血糖升高，但注射STZ后大鼠出現(xiàn)糖尿病狀態(tài)。

DCM可表現(xiàn)為兩種類型：限制性心肌病與擴張型心肌病，早期表現(xiàn)為限制性心肌病，主要為舒張功能不全，晚期擴張型心肌病多見，表現(xiàn)為左室肥厚，左室擴大，左室舒張末壓增高，收縮功能受損。有文獻報道[16-17]：DCM的病理形態(tài)特征為，顯微鏡下可見單個或多個心肌細胞呈凝固性壞死，伴有少許漿細胞浸潤或淋巴細胞，纖維組織替代壞死的心肌細胞。本實驗病理切片與文獻報道基本一致，有利于判定造模成功。

綜上所述，高脂、高糖膳食并小劑量STZ腹腔注射是目前建立2型糖尿病的主要方法，簡單易行，成功率高，為研究DCM的發(fā)病機制及臨床防治提供了理論基礎。

[參考文獻]

[1] Yang W，Lu J，Weng J，et al.Prevalence of diabetes among men and women in China[J].N Engl J Med，2010，362（12）：1090-1101.

[2] Resl M，Hülsmann M，Pacher R，et al.Heart failure in diabetes[J].Wien Med Wochenschr，2009，159（5-6）：134-140.

[3] 董世芬，洪纓，樊江波，等.實驗性 2 型糖尿病心肌病大鼠模型的建立與評價[J].中國實驗動物學報，2009，7（4）：245-251.

[4] 鄭彩虹，郭志新.2型糖尿病大鼠心臟組織MCP-1表達及替米沙坦對其影響[J].中國醫(yī)療前沿，2008，3（22）：20， 22.

[5] 王吉耀，廖二元，黃從新，等.內科學[M] .北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：1028-1030.

[6] Ruler S，Dlugash J，Yuceoglu YZ，et al.New type of cardiomyopathy associated with diabetic glomerulosclerosis[J].AM J Cardiol，1972，30（6）：595-602.

[7] Fein FS.Diabetic Cardiomyopathy[J].Diabetes Care，1990， 13（11）：1169-1179.

[8] 徐華，何毅，張鳴號，等.1型糖尿病大鼠模型的建立及糖尿病并發(fā)癥相關指標的測定[J].寧夏醫(yī)科大學學報，2010，32（1）：90-92.

[9] 黃昶荃，肖謙，趙柯湘，等.2 型糖尿病心肌病變模型建立方法的實驗研究 [J].重慶醫(yī)科大學學報，2007，32（1）：15-18.

[10] Hsueh W，Abel ED，Breslow JL，et al.Recipes for creating animal models of diabetic cardiovascular disease[J].Circ Res，2007，100（10）： 1415-1427.

[11] Buchanan J，Mazumder P K，Hu P，et al.Reduced cardiac efficiency and altered substrate metabolism precedes the onset of hyperglycemia and contractile dysfunction in two mouse models of insulin resistance and obesity[J].Endocrinology，2005，146（12）：5341-5349.

[12] McQueen AP，Zhang D，Hu P，et al.Contractile dysfunction in hypertrophied hearts with deficient insulin receptor signaling：possible role of reduced capillary density[J].J Mol Cell Cardiol，2005，39（6）：882-892.

[13] Park SY，Cho YR，Hyo-Jeong Kim，et al.Vnraveling the temporal pattern of diet-induced insulin resistance in individual organs and cardiac dystaction in C57BC/6 mice[J].Diabetes，2005，54（12）：3530-3540.

[14] 汪新安，艾文，朱麗華，等.鏈脲佐菌素誘導建立C57BC/6小鼠1型糖尿病心肌病模型的可行性研究[J].實用醫(yī)學雜志，2010，26（9）：1518-1520.

[15] Westermeier F，Sáez PJ，Villalobos-Labra R，et al.Programming of fetal insulin resistance in pregnancies with maternal obesity by ER stress and inflammation[J].Biomed Res Int， 2014：917672.[ Epub 2014 Jun 30]

[16] Cai L，Li W，Wang G，et al.Hyperglycemia-induced apoptosis in mouse myocardium mitochondrial cytochrome C-mediated caspase-3 activation pathway[J].Diabetes，2002， 51（6）：1938-1948.

[17] 劉冬戈，喬旭柏，杜俊，等.糖尿病心肌病的組織病理學觀察[J].中華病理學雜志，2007，36（12）：801-804.

（收稿日期：2014-06-06 本文編輯：許俊琴）

DCM可表現(xiàn)為兩種類型：限制性心肌病與擴張型心肌病，早期表現(xiàn)為限制性心肌病，主要為舒張功能不全，晚期擴張型心肌病多見，表現(xiàn)為左室肥厚，左室擴大，左室舒張末壓增高，收縮功能受損。有文獻報道[16-17]：DCM的病理形態(tài)特征為，顯微鏡下可見單個或多個心肌細胞呈凝固性壞死，伴有少許漿細胞浸潤或淋巴細胞，纖維組織替代壞死的心肌細胞。本實驗病理切片與文獻報道基本一致，有利于判定造模成功。

綜上所述，高脂、高糖膳食并小劑量STZ腹腔注射是目前建立2型糖尿病的主要方法，簡單易行，成功率高，為研究DCM的發(fā)病機制及臨床防治提供了理論基礎。

[參考文獻]

[1] Yang W，Lu J，Weng J，et al.Prevalence of diabetes among men and women in China[J].N Engl J Med，2010，362（12）：1090-1101.

[2] Resl M，Hülsmann M，Pacher R，et al.Heart failure in diabetes[J].Wien Med Wochenschr，2009，159（5-6）：134-140.

[3] 董世芬，洪纓，樊江波，等.實驗性 2 型糖尿病心肌病大鼠模型的建立與評價[J].中國實驗動物學報，2009，7（4）：245-251.

[4] 鄭彩虹，郭志新.2型糖尿病大鼠心臟組織MCP-1表達及替米沙坦對其影響[J].中國醫(yī)療前沿，2008，3（22）：20， 22.

[5] 王吉耀，廖二元，黃從新，等.內科學[M] .北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：1028-1030.

[6] Ruler S，Dlugash J，Yuceoglu YZ，et al.New type of cardiomyopathy associated with diabetic glomerulosclerosis[J].AM J Cardiol，1972，30（6）：595-602.

[7] Fein FS.Diabetic Cardiomyopathy[J].Diabetes Care，1990， 13（11）：1169-1179.

[8] 徐華，何毅，張鳴號，等.1型糖尿病大鼠模型的建立及糖尿病并發(fā)癥相關指標的測定[J].寧夏醫(yī)科大學學報，2010，32（1）：90-92.

[9] 黃昶荃，肖謙，趙柯湘，等.2 型糖尿病心肌病變模型建立方法的實驗研究 [J].重慶醫(yī)科大學學報，2007，32（1）：15-18.

[10] Hsueh W，Abel ED，Breslow JL，et al.Recipes for creating animal models of diabetic cardiovascular disease[J].Circ Res，2007，100（10）： 1415-1427.

[11] Buchanan J，Mazumder P K，Hu P，et al.Reduced cardiac efficiency and altered substrate metabolism precedes the onset of hyperglycemia and contractile dysfunction in two mouse models of insulin resistance and obesity[J].Endocrinology，2005，146（12）：5341-5349.

[12] McQueen AP，Zhang D，Hu P，et al.Contractile dysfunction in hypertrophied hearts with deficient insulin receptor signaling：possible role of reduced capillary density[J].J Mol Cell Cardiol，2005，39（6）：882-892.

[13] Park SY，Cho YR，Hyo-Jeong Kim，et al.Vnraveling the temporal pattern of diet-induced insulin resistance in individual organs and cardiac dystaction in C57BC/6 mice[J].Diabetes，2005，54（12）：3530-3540.

[14] 汪新安，艾文，朱麗華，等.鏈脲佐菌素誘導建立C57BC/6小鼠1型糖尿病心肌病模型的可行性研究[J].實用醫(yī)學雜志，2010，26（9）：1518-1520.

[15] Westermeier F，Sáez PJ，Villalobos-Labra R，et al.Programming of fetal insulin resistance in pregnancies with maternal obesity by ER stress and inflammation[J].Biomed Res Int， 2014：917672.[ Epub 2014 Jun 30]

[16] Cai L，Li W，Wang G，et al.Hyperglycemia-induced apoptosis in mouse myocardium mitochondrial cytochrome C-mediated caspase-3 activation pathway[J].Diabetes，2002， 51（6）：1938-1948.

[17] 劉冬戈，喬旭柏，杜俊，等.糖尿病心肌病的組織病理學觀察[J].中華病理學雜志，2007，36（12）：801-804.

（收稿日期：2014-06-06 本文編輯：許俊琴）

DCM可表現(xiàn)為兩種類型：限制性心肌病與擴張型心肌病，早期表現(xiàn)為限制性心肌病，主要為舒張功能不全，晚期擴張型心肌病多見，表現(xiàn)為左室肥厚，左室擴大，左室舒張末壓增高，收縮功能受損。有文獻報道[16-17]：DCM的病理形態(tài)特征為，顯微鏡下可見單個或多個心肌細胞呈凝固性壞死，伴有少許漿細胞浸潤或淋巴細胞，纖維組織替代壞死的心肌細胞。本實驗病理切片與文獻報道基本一致，有利于判定造模成功。

綜上所述，高脂、高糖膳食并小劑量STZ腹腔注射是目前建立2型糖尿病的主要方法，簡單易行，成功率高，為研究DCM的發(fā)病機制及臨床防治提供了理論基礎。

[參考文獻]

[1] Yang W，Lu J，Weng J，et al.Prevalence of diabetes among men and women in China[J].N Engl J Med，2010，362（12）：1090-1101.

[2] Resl M，Hülsmann M，Pacher R，et al.Heart failure in diabetes[J].Wien Med Wochenschr，2009，159（5-6）：134-140.

[3] 董世芬，洪纓，樊江波，等.實驗性 2 型糖尿病心肌病大鼠模型的建立與評價[J].中國實驗動物學報，2009，7（4）：245-251.

[4] 鄭彩虹，郭志新.2型糖尿病大鼠心臟組織MCP-1表達及替米沙坦對其影響[J].中國醫(yī)療前沿，2008，3（22）：20， 22.

[5] 王吉耀，廖二元，黃從新，等.內科學[M] .北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：1028-1030.

[6] Ruler S，Dlugash J，Yuceoglu YZ，et al.New type of cardiomyopathy associated with diabetic glomerulosclerosis[J].AM J Cardiol，1972，30（6）：595-602.

[7] Fein FS.Diabetic Cardiomyopathy[J].Diabetes Care，1990， 13（11）：1169-1179.

[8] 徐華，何毅，張鳴號，等.1型糖尿病大鼠模型的建立及糖尿病并發(fā)癥相關指標的測定[J].寧夏醫(yī)科大學學報，2010，32（1）：90-92.

[9] 黃昶荃，肖謙，趙柯湘，等.2 型糖尿病心肌病變模型建立方法的實驗研究 [J].重慶醫(yī)科大學學報，2007，32（1）：15-18.

[10] Hsueh W，Abel ED，Breslow JL，et al.Recipes for creating animal models of diabetic cardiovascular disease[J].Circ Res，2007，100（10）： 1415-1427.

[11] Buchanan J，Mazumder P K，Hu P，et al.Reduced cardiac efficiency and altered substrate metabolism precedes the onset of hyperglycemia and contractile dysfunction in two mouse models of insulin resistance and obesity[J].Endocrinology，2005，146（12）：5341-5349.

[12] McQueen AP，Zhang D，Hu P，et al.Contractile dysfunction in hypertrophied hearts with deficient insulin receptor signaling：possible role of reduced capillary density[J].J Mol Cell Cardiol，2005，39（6）：882-892.

[13] Park SY，Cho YR，Hyo-Jeong Kim，et al.Vnraveling the temporal pattern of diet-induced insulin resistance in individual organs and cardiac dystaction in C57BC/6 mice[J].Diabetes，2005，54（12）：3530-3540.

[14] 汪新安，艾文，朱麗華，等.鏈脲佐菌素誘導建立C57BC/6小鼠1型糖尿病心肌病模型的可行性研究[J].實用醫(yī)學雜志，2010，26（9）：1518-1520.

[15] Westermeier F，Sáez PJ，Villalobos-Labra R，et al.Programming of fetal insulin resistance in pregnancies with maternal obesity by ER stress and inflammation[J].Biomed Res Int， 2014：917672.[ Epub 2014 Jun 30]

[16] Cai L，Li W，Wang G，et al.Hyperglycemia-induced apoptosis in mouse myocardium mitochondrial cytochrome C-mediated caspase-3 activation pathway[J].Diabetes，2002， 51（6）：1938-1948.

[17] 劉冬戈，喬旭柏，杜俊，等.糖尿病心肌病的組織病理學觀察[J].中華病理學雜志，2007，36（12）：801-804.

（收稿日期：2014-06-06 本文編輯：許俊琴）