聚丙烯酰胺降解菌篩選與分子生物學(xué)鑒定

任國(guó)領(lǐng)，徐晶雪，王 晶，張 虹，樂(lè)建君，黃永紅

（1.大慶師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 大慶 163712； 2.大慶油田有限責(zé)任公司 勘探開(kāi)發(fā)研究院，黑龍江 大慶163712）

聚丙烯酰胺降解菌篩選與分子生物學(xué)鑒定

任國(guó)領(lǐng)1，徐晶雪1，王 晶1，張 虹1，樂(lè)建君2，黃永紅1

（1.大慶師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 大慶 163712； 2.大慶油田有限責(zé)任公司 勘探開(kāi)發(fā)研究院，黑龍江 大慶163712）

從大慶油田聚驅(qū)后油藏采出水中篩選出一株降解聚丙烯酰胺的細(xì)菌菌株——QSJU001.該菌株能在以聚丙烯酰胺為惟一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng).對(duì)該菌進(jìn)行16S r DNA序列的分子生物學(xué)鑒定，測(cè)得的16S rDNA序列與GenBank中最相近的前10個(gè)菌株的相似性均為99%.利用該菌屬與最相近的前10個(gè)菌株構(gòu)建該菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示該菌株與Acinetobacter baumannii strain KK14菌株的堿基差別最小.該菌的形態(tài)特征觀(guān)察、生理生化特征檢測(cè)、16S r DNA分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明，菌株QSJU001與Acinetobacter baumannii strain KK14親緣關(guān)系最近，屬于不動(dòng)桿菌屬.降解率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株QSJU001對(duì)聚丙烯酰胺降解率基本穩(wěn)定在33%左右，對(duì)聚丙烯酰胺的降解效果較好.

聚丙烯酰胺；降解菌；篩選；不動(dòng)桿菌屬

0 引言

聚合物驅(qū)油技術(shù)作為重要接替技術(shù)已在大慶油田得到大規(guī)模應(yīng)用，在油田增加可采儲(chǔ)量、控制產(chǎn)量遞減方面發(fā)揮巨大作用[1]；但是聚合物的殘留、污染問(wèn)題也隨之而來(lái)，尤其是大慶油田聚驅(qū)后油藏及三元復(fù)合驅(qū)油藏采出液污水處理已經(jīng)成為一項(xiàng)重要工作[2].解決聚丙烯酰胺殘留、污染及進(jìn)行采出液污水處理等問(wèn)題的關(guān)鍵是聚丙烯酰胺降解.

目前，國(guó)內(nèi)外聚丙烯酰胺降解技術(shù)主要有化學(xué)降解、機(jī)械降解、光降解和生物降解等[3].生物降解技術(shù)[4-6]具有無(wú)污染、成本低、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的發(fā)展前景，篩選聚丙烯酰胺降解菌尤為重要.目前，研究人員已篩選出包括細(xì)菌、放線(xiàn)菌、真菌和古菌等微生物菌群在內(nèi)的種類(lèi)豐富的降解聚丙烯酰胺菌株，如假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、硫酸還原菌、腐生菌、白腐真菌、梭菌屬、放線(xiàn)桿菌屬等[7-13]，這些菌株能在一定程度上降解聚丙烯酰胺.

筆者通過(guò)富集培養(yǎng)和劃線(xiàn)分離，從大慶油田聚驅(qū)后油藏采出水中，篩選出一株能在以聚丙烯酰胺為惟一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)降解聚丙烯酰胺的菌株，并通過(guò)16S r DNA分子生物學(xué)序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建鑒定，為聚丙烯酰胺殘留、污染及提高聚驅(qū)后油藏原油采收率等提供技術(shù)支持.

1 材料和方法

1.1 菌種來(lái)源、培養(yǎng)基

（1）菌種來(lái)源于大慶油田聚驅(qū)后油藏采出水.

（2）富集培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：酵母浸粉5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L、聚丙烯酰胺1.5 g/L，p H為7.0.無(wú)機(jī)鹽選擇性液體培養(yǎng)基：聚丙烯酰胺0.6 g/L、磷酸氫二鈉0.5 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、氯化鈉10.0 g/L、磷酸二氫鈉0.5 g/L、硝酸銨10.0 g/L，p H為7.2.無(wú)機(jī)鹽選擇性固體培養(yǎng)基：向無(wú)機(jī)鹽選擇性液體培養(yǎng)基中加入15.0 g/L的瓊脂粉，制成平板.

1.2 菌株篩選、純化及生理生化性能測(cè)定1.2.1 富集、篩選馴化

取適量大慶油田聚驅(qū)后油藏采出水于富集培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）中，放入溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h，菌種富集培養(yǎng).將富集培養(yǎng)的菌液5 m L接種到選擇培養(yǎng)基中，于溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)，采用逐步提高聚丙烯酰胺質(zhì)量濃度方法，對(duì)菌株馴化培養(yǎng)，最終聚丙烯酰胺質(zhì)量濃度為1.2 g/L，得到聚丙烯酰胺降解菌.

1.2.2 分離純化

將聚丙烯酰胺質(zhì)量濃度為1.2 g/L的液體選擇培養(yǎng)基菌液進(jìn)行稀釋涂布，三區(qū)劃線(xiàn)，進(jìn)行菌落形態(tài)觀(guān)察和進(jìn)行顯微鏡觀(guān)察，重復(fù)劃線(xiàn)分離，直到確定其為單一菌株為止.

1.2.3 生理生化性能測(cè)定

菌株生理生化性能測(cè)定主要進(jìn)行革蘭氏染色、葡萄糖產(chǎn)酸、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、VP實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、硫化氫實(shí)驗(yàn)等.

1.3 菌株分子生物學(xué)鑒定

1.3.1 基因組DNA的提取

基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)[14].

1.3.2 16S r DNA的PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增用于克隆文庫(kù)的16S r DNA引物為大多數(shù)細(xì)菌16S r DNA通用引物為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTT GTTACGACTT-3'[15]，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)約為1 500 bp.PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：1μL模板，12.5μL Premix Taq VERSION，1μL正向引物（25 mmol/L），1μL反向引物 （25 mmol/μL）和適量超純水（補(bǔ)足25μL）.PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃溫度預(yù)變性5 min，循環(huán)過(guò)程為：94℃溫度45 s；54℃溫度45 s；72℃溫度2 min，32個(gè)循環(huán)；72℃溫度延伸10 min.

1.3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物16S r DNA的序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物與PUC18-T vector連接，將連接子進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取克隆子保存在LB培養(yǎng)基中.將菌液送北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序.測(cè)得的序列經(jīng)過(guò)拼接處理后，以FASTA格式在GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，尋找最相似的已知序列及最相似的已知分類(lèi)地位序列.

為進(jìn)一步顯示供試菌株和已知菌株的親緣關(guān)系及系統(tǒng)地位，根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，采用MEGA 4生物學(xué)軟件中的Neighbor-joining方法構(gòu)建測(cè)試菌株和相關(guān)菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[16].

1.4 菌株降解性能評(píng)價(jià)

采用油田常用的淀粉—碘化鎘方法測(cè)定聚丙烯酰胺質(zhì)量濃度[17].

2 結(jié)果分析

2.1 菌株的篩選結(jié)果

聚驅(qū)后油藏采出水經(jīng)富集培養(yǎng)基培養(yǎng)后在聚丙烯酰胺質(zhì)量濃度分別為0.3、0.6、0.9、1.2 g/L依次遞增的選擇性液體培養(yǎng)基中馴化和分離菌株（見(jiàn)圖1）；采用梯度稀釋方法，在聚丙烯酰胺質(zhì)量濃度為1.2 g/L的選擇性固體培養(yǎng)基中稀釋涂布.涂布后，觀(guān)察菌落生長(zhǎng)情況（見(jiàn)圖2）.選取分離效果好的平板多次進(jìn)行三區(qū)劃線(xiàn)分離，分離至第4代，挑取單菌落于斜面保存，得到一株降解聚丙烯酰胺菌株，命名為QSJU001.

2.2 菌株的形態(tài)及生理生化特征

對(duì)分離得到的降解聚丙烯酰胺菌株QSJU001進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀(guān)察.菌株QSJU001的表面形態(tài)特征和生理生化特征見(jiàn)表1.由表1可知，QSJU001菌落形態(tài)為菌落圓形、光滑、灰白色、邊緣整齊；QSJU001菌株形態(tài)為短粗桿狀、無(wú)鞭毛、不形成芽孢.

圖1 不同聚丙烯酰胺質(zhì)量濃度遞增馴化菌株Fig.1 The acclimated strains of different polyacrylamide concentrations

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)菌液梯度稀釋法稀釋涂布Fig.2 Gradient dilution coating diagram with different quality score bacilli

表1 菌株QSJU001的表面形態(tài)特征和生理生化特征Table 1 physiological and biochemical characteristics of the QSJU001 strain

對(duì)分離的菌株進(jìn)行革蘭氏染色及生理生化檢測(cè).由表1還可知，該菌株屬于革蘭氏陰性菌，葡萄糖產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，吲哚實(shí)驗(yàn)、VP實(shí)驗(yàn)、甲基紅實(shí)驗(yàn)、硫化氫實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性.

2.3 菌株16S rDNA序列測(cè)定結(jié)果

菌株16S r DNA全序列拼接結(jié)果顯示：菌株QSJU001 16S r DNA全長(zhǎng)含有1 500 bp核苷酸.將測(cè)得序列通過(guò)NCBI網(wǎng)站的BLAST程序與GenBank中已報(bào)道的16S r DNA序列進(jìn)行同源性比較.菌株QSJU001 16S r DNA序列最相近的前10個(gè)菌株的GenBank登錄號(hào)和相似性見(jiàn)表2.由表2可知，菌株QSJU001 16S r DNA序列與最相近的前10個(gè)菌株的GenBank相似性均為99%.

表2 菌株QSJU001 16S rDNA的測(cè)序結(jié)果Table 2 The result of 16S r DNA sequence determination of the QSJU001 strain

2.4 菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)創(chuàng)建

將測(cè)序得到的QSJU001 16S r DNA序列與BLAST比對(duì)得到前10個(gè)最相近菌株的16S r DNA序列，利用MEGA4軟件，采用Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（見(jiàn)圖3）.由圖3可知，16Sr DNA系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果表明，QSJU001與Acinetobacter baumannii strain KK14（GQ200824）堿基差別最小.結(jié)合形態(tài)特征觀(guān)察、生理生化特征檢測(cè)、16S r DNA比對(duì)結(jié)果可以判定菌株QSJU001與Acinetobacter baumannii strain KK14親緣關(guān)系最近，屬于不動(dòng)桿菌屬.

圖3 基于QSJU001和相近菌株的16S r DNA構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phytogenetic neighbor-joining tree based on the 16S rDNA genes from the QSJU001strain and their nearest neighbors retrieved from GenBank

2.5 菌株對(duì)聚丙烯酰胺的降解作用

由于大慶油田采出水中聚丙烯酰胺質(zhì)量濃度約為400 mg·L-1，所以進(jìn)行菌株降解實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇性培養(yǎng)基中聚丙烯酰胺質(zhì)量濃度為400 mg·L-1.菌株QSJU001降解聚丙烯酰胺降解率隨時(shí)間變化結(jié)果見(jiàn)表3.由表3可知，QSJU001菌株對(duì)聚丙烯酰胺的降解主要是在前5 d，5 d后基本達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，降解率基本穩(wěn)定在33%左右.

表3 菌株QSJU001降解聚丙烯酰降解率隨降解時(shí)間變化結(jié)果Table 3 The change of degrading rate in different time of the QSJU001 strain

3 結(jié)論

（1）采用大慶油田聚驅(qū)后采出水中富集培養(yǎng)、聚丙烯酰胺質(zhì)量濃度遞增馴化選擇培養(yǎng)（聚丙烯酰胺質(zhì)量濃度依次為0.3、0.6、0.9、1.2 g/L）、梯度稀釋涂布、平板三區(qū)劃線(xiàn)等技術(shù)，分離純化得到微生物菌株，并證實(shí)該菌株能夠在質(zhì)量濃度為1.2 g/L聚丙烯酰胺為惟一碳源的選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng).

（2）結(jié)合形態(tài)特征觀(guān)察、生理生化特征檢測(cè)、16S r DNA分子生物學(xué)鑒定，菌株QSJU001與Acinetobacter baumannii strain KK14親緣關(guān)系最近，屬于不動(dòng)桿菌屬.

（3）菌株QSJU001對(duì)聚丙烯酰胺的降解主要在降解的前5 d，降解率穩(wěn)定在33%左右，降解效果較好.

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TE357.43

A

2095-4107（2014）04-0067-05

DOI 10.3969/j.issn.2095-4107.2014.04.010

2014-04-05；

關(guān)開(kāi)澄

大慶師范學(xué)院博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（12ZR06）；黑龍江省青年科學(xué)基金項(xiàng)目（QC2011094）

任國(guó)領(lǐng)（1980-），男，博士，副教授，主要從事微生物采油技術(shù)方面的研究.

黃永紅，E-mail：yonghongh2003@163.com