馮子明，袁中平，董謝平，鄧 亮，付 旸

（江西省人民醫(yī)院骨科，南昌 330006）

實體腫瘤的生長和轉移與血管生成密切相關。目前，大多數研究者采用CD34等泛血管內皮細胞標記物檢測腫瘤新生血管的微血管密度（microvessel density,MVD）［1-4］。本研究采用免疫組織化學方法檢測CD34抗體轉移瘤微血管的分布，探討轉移癌微血管表達的特點。

1 資料與方法

1.1 病例資料

選擇江西省人民醫(yī)院2007年6月至2013年6月手術切除轉移瘤組織標本43例 （轉移癌組），均經病理檢查證實。其中男27例，女15例，年齡30～77歲，平均49.48歲；鱗癌轉移瘤25例，直腸癌轉移瘤18例。另選擇同期本院的手術切除舌鱗癌癌組織標本11例（鱗癌組），男6例，女5例，年齡 25～63歲，平均 38.7歲。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑

石蠟切片機 （SLEE,德國）；0.5～10.0 μL 單道電動數字移液器（Brand，德國）；微波爐（格蘭仕，廣東）；電熱恒溫箱 PVD-050，上海）；雙筒顯微鏡（Olympus，日本）；顯微照相系統(tǒng)（Nikon,AFX-ⅡA，日本）。鼠抗人單克隆抗體CD34（即用型）、SP免疫組化試劑盒（即用型）及DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.2.2 CD34染色方法及結果判定

CD34染色均采用免疫組織化學SP法檢測。樣本經體積分數為10%中性甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚切片后，按試劑盒說明書操作步驟進行檢測。所有切片結果應用數碼相機采集圖像，彩色細胞圖像分析系統(tǒng)計數微血管密度（MVD）值。CD34在光學顯微鏡下將血管內皮細胞染為棕黃色。

1.2.3 MVD的測定

采用Weidner等［5］提出的方法對研究結果進行MVD量化分析。首先在40倍光學顯微鏡視野下掃視整個切片，尋找血管高密度集中的區(qū)域；在200倍光學顯微鏡視野下，應用顯微照相系統(tǒng)計數微血管數目，各計數3個高倍視野，取其平均值作為該標本的MVD數。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 14.0統(tǒng)計分析軟件包對全部數據進行組間t檢驗及秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

CD34將腫瘤組織微血管標本染為棕黃色，在腫瘤組織的微小血管及大血管上表達均較強，與其他組織分界清楚。轉移癌組的標本在200光學顯微鏡視野下，應用顯微照相系統(tǒng)計數微血管數目為2～6根；鱗癌組標本的微血管數目為14～19根。見封四圖1—2。轉移癌組CD34的表達明顯低于鱗癌組（P＜0.01）；2組標本血管標記物標記的癌組織MVD值在男女患者間比較差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）；CD34標記的MVD值在不同的轉移瘤之間比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 CD34標記轉移瘤、鱗癌MVD的比較 根

3 討論

血管生成是腫瘤生長、侵襲、轉移和復發(fā)的基礎，腫瘤血管的生成與促血管生成因子、腫瘤細胞分泌激素及基因調控等諸多因素有關，其中血管生長刺激因子和血管生長抑制因子作用平衡與否，決定了血管生成是促進還是抑制［6］。當腫瘤體積增長＞1～2 mm-3時，如無新生血管長入，腫瘤組織將保持靜止狀態(tài)或退化［7］。新生血管長入腫瘤后血液供應豐富,新生血管不僅為腫瘤組織提供足夠的營養(yǎng)和氧,還提供大量的生長因子,促使腫瘤迅速生長。血管生成也與腫瘤轉移有著重要的關系，因為腫瘤新生血管不成熟，結構缺乏完整性和細胞間連接，管壁薄弱，僅排列一層內皮細胞，缺乏平滑肌，基膜也不完整，因此穿透性較高，腫瘤細胞容易穿透微血管壁發(fā)生轉移；腫瘤新生血管形成后使腫瘤病灶組織間質內液體量和壓力增高，從而使淋巴回流增加，腫瘤細胞通過淋巴管系統(tǒng)轉移，亦是促使腫瘤轉移的重要影響因素。腫瘤內MVD與腫瘤的惡性程度也有密切的關系，目前原發(fā)腫瘤組織內的MVD已成為預測腫瘤轉移、復發(fā)及判斷預后的一項重要指標。本研究對轉移瘤血管生成進行分析，發(fā)現原發(fā)癌與轉移瘤在血管生成有明顯差異，轉移瘤血管形成較原發(fā)腫瘤明顯減少（P＜0.01）。

腫瘤血管生成與缺氧有明顯的關系，缺氧是實體性腫瘤物理微環(huán)境的基本特征之一。腫瘤生長速度快，腫瘤細胞大量生長需氧量增加，當氧的需求超過供給，并且因腫瘤組織快速生長間質內壓力增高，使腫瘤內不成熟的血管塌陷，腫瘤病灶微環(huán)境缺氧加重；缺氧將刺激腫瘤細胞和宿主細胞合成分泌多種促血管生成因子，促進局部新生血管形成；缺氧還通過缺氧誘導因子1（hypoxia induced factor-1,HIF-1）上調血管內皮生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體的表達［8-9］。

目前的研究［10］認為，與腫瘤血管生成相關的基因主要有Rac-1、p53及PTEN。Rac-1是Rho家族蛋白中的一個分子，Rho GTPases是一組相對分子量為20000～25000的單體鳥苷酸結合蛋白，屬小G蛋白家族。Rac-1在缺氧狀況下促進HIF-1的活化，并且加強HIF-1的轉錄活性和蛋白表達。同時還發(fā)現 Rac-1可調節(jié)細胞外基質（ECM）和VEGF誘導內皮細胞的趨化作用，促進內皮細胞的增殖、運動和遷移，是VEGF后信號通路的一個重要中間分子。因此，目前認為Rac-1可能也是血管生成過程中的一個重要的調控因子［10］。

p53可以抑制腫瘤血管生成，其的缺失或突變可導致腫瘤血管增生明顯。p53的作用機制主要是通過泛素介導的蛋白水解作用，降解HIF－1α，從而抑制 HIF－1α 介導的血管生成［11－12］。有學者［13－14］研究發(fā)現，隨著腫瘤組織細胞缺氧時間的延長，p53表達水平出現逐漸下降的趨勢，而與VEGF表達的上升呈現相反趨勢。因此，增強p53基因的表達可以抑制腫瘤血管的生成。

近年來的研究［14］認為，人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）是與腫瘤血管生成有關的基因，位于染色體10 q23.3，編碼一雙特異性的磷酸酶，起抑制調控PI3K2AKT，導致細胞周期的停滯和凋亡。隨著腫瘤組織缺氧時間的延長，PTEN蛋白的表達出現逐漸下降趨勢，而與VEGF表達的上升呈現相反趨勢。Jiang等［15］的研究也發(fā)現，PTEN高表達可抑制雞尿囊胚血管生成，并通過PI3K2AKT途徑抑制VEGF的表達。

腫瘤血管生成的過程是腫瘤細胞和正常細胞產生的具有相反作用的血管生成因子不平衡作用的結果。目前，在人類腫瘤血管生成方面的研究中，檢測腫瘤血管生成是通過測定MVD來實現的，通過血管內皮細胞標記物進行測量是公認的能夠代表腫瘤血管生成狀態(tài)的方法。研究已經發(fā)現的血管內皮細胞標記物主要有 CD31、CD34、Tie2、E9 及TEC等［16］。本研究采用CD34作為腫瘤血管內皮細胞標記物檢測腫瘤新生血管的MVD，轉移癌組微血管數目為2～6根；鱗癌組標本的微血管數目為14～19根。應用SPSS14.0統(tǒng)計分析軟件包對全部數據進行組間t檢驗及秩和檢驗，轉移癌組CD34的表達明顯低于鱗癌組（P＜0.01）；血管標記物標記的癌組織MVD值在男、女患者間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），CD34 標記的 MVD 值在不同的轉移瘤之間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。如果對轉移瘤血管在血管生成因子，腫瘤血管生成相關基因Rac－1、p53及PTEN的表達等方面進行研究可能會有更多的新發(fā)現。

［1］Hasan J，Shnyder S D，Bibby M,et al.Quantitative angiogenesis assays in vivo－a review［J］.Angiogenesis，2004，7（1）:1－16.

［2］Shivakumar S，Prabhakar B T，Jayashree K，et al.Evaluation of serum vascular endothelial growth factor（VEGF）and microvessel density（MVD）as prognostic indicators in carcinoma breast［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2009，135，（4）:627－636.

［3］Benckert C,Thelen A,Cramer T,et al.Impact of microvessel density on lymph node metastasis and survival after curative resection of pancreatic cancer［J］.Surgery Today,2012,42（2）:169－176.

［4］Hansen T F,Sorensen F B,Spindler K L,et al.Microvessel density and the association with single nucleotide polymorphisms of the vascular endothelial growth factor receptor 2 in patients with colorectal cancer［J］.Virchows Archiv,2010,456（3）:251－260.

［5］Weidner N,Semple J P,Welch W R,et al.Tumor angiogenesis and metastasis－correlation in invasive breast carcinoma［J］.N Engl J Med,1991,324（1）:1－8.

［6］Ferrara N,Gerber H P,Couter J.The biology of VEGF and its receptors［J］.Nat Med,2003,9（6）:669－676.

［7］Nesbit M.Abrogation of tumor vasculature using gene therapy［J］.Cancer Metastasis Rev,2000,19 （1/2）:45－49.

［8］Folkman J.Role of angiogensis in tumor growth and metastasis ［J］.Semin Oncol,2002,29（6 S16）:15－18.

［9］Nyberg P,Xie L,Kalluri R.Endogenous inhibitors of angiogensis［J］.Cancer Res,2005,65（10）:3967－3979.

［10］薛妍,畢鋒,劉文超,等.缺氧狀況下 Rho GTPases的表達和活性變化及其與腫瘤血管生成關系的研究［J］.中華腫瘤雜志,2004,26（9）:517－520.

［11］Matsubara T,Funabiki T,Jinno O,et al.p53 Gene mutations and overexpression of p53 product in cancerous and noncancerous biliary epithelium in patients with pancreaticobiliary maljunction［J］.J Hepatobiliary Pancreat Surg,1999,6（3）:286－293.

［12］Biesaga B,Niemiec J,Ziobro M.Microvessel density and status of p53 protein as potential prognostic factors for adjuvant anthracycline chemotherapy in retrospective analysis of early breast cancer patients group ［J］.Pathol Oncol Res,2012,18（4）:949－960.

［13］Breier G,Blum S,Peli J,et al.Transforming growth factor2beta and Ras regulate the VEGF/VEGF2receptor system during tumor angiogenesis［J］.Cancer,2002,97（2）:142－148.

［14］Ravi R,Mookerjee B,Bhuj walla Z M,et al.Regulation of tumor angiogenesis by p53－induced degradation of hypoxia－inducible factor 1alpha［J］.Genes Dev,2000,14（1）:34－44.

［15］Jiang B H,Zheng J Z,Aoki M,et al.Phosphatidylinositol 3－kinase signaling mediates angiogenesis and expression of vascular endothelial growth factor in endothelialcells［J］.ProcNatlAcadSciUSA,2000,97（4）:1749－1753.

［16］Miyata Y,Sagara Y,Watanabe S,et al.CD105 is a more appropriate marker for evaluating angiogenesis in urothelial cancer of the upper urinary tract than CD31 or CD34［J］.Virchows Archiv,2013,463,（5）:673－679.