王 靜，龔方華，張彥婷，王瑞莉，薛樂勛 ，關(guān)方霞#

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院細(xì)胞生物學(xué)研究室 鄭州 450052

過氧化物酶廣泛存在于真核生物中，作為一種抗氧化劑，可以催化H2O2以及脂質(zhì)氫過氧化物還原，避免細(xì)胞受損[1]。過氧化物酶1(peroxiredoxin 1，Prdx1)是過氧化物酶家族中分布最為廣泛的成員之一，廣泛分布于胞質(zhì)、胞核中，參與細(xì)胞內(nèi)多種生理過程，例如Prdx1對H2O2介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有調(diào)節(jié)作用[2]。Prdx1 還存在于鞭毛中[3]，但是其在鞭毛中的功能未知。杜氏鹽藻是一種單細(xì)胞真核藻類，可以在極端高鹽的環(huán)境下生長，具有等長雙鞭毛，因而非常適合作為研究鞭毛內(nèi)信號通路的模式生物[4]。該實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建杜氏鹽藻過氧化物酶1(Dunaliella salina Prdx1，DsPrdx1)酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Prdx1，并分別轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187和AH109，檢測其對酵母菌株有無毒性和自激活作用，為篩選DsPrdx1相互作用蛋白、研究其在鞭毛中的功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 杜氏鹽藻藻株為UTEX-LB-1644，購自美國得克薩斯州大學(xué)，大腸桿菌DH5α和杜氏鹽藻cDNA酵母文庫由作者所在的實(shí)驗(yàn)室保存，酵母菌株Y187和 AH109、載體 pGBKT7購自 Clontech公司，載體pGEM-T購自Promega公司。酵母培養(yǎng)基購自上海 Genomics公司，X-α-gal購自Sigma公司，EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA連接酶均購自大連TaKa-Ra公司，質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司，PCR特異性引物由Sangon公司合成，紫外分光光度計購自Thermo公司，PCR儀購自Biometra公司，電泳儀購自北京六一實(shí)驗(yàn)儀器廠，凝膠成像儀購自Synoptics公司。

1.2 DsPrdx1開放閱讀框(ORF)的擴(kuò)增 設(shè)計上、下游分別含有EcoRⅠ與BamHⅠ位點(diǎn)的特異性引物[Prdx-ORF上游引物:5'-CCGGAATTCATGCCTG TACCCACGATT-3'(EcoRⅠ)，Prdx-ORF 下游引物:5'-CGCGGATCCTTATGACAGGGTGTTGAAGT-3'(BamHⅠ)]，以杜氏鹽藻cDNA為模板，PCR擴(kuò)增DsPrdx1(GenBank序列號 KC999111)的 ORF。100 μL PCR反應(yīng)體系中含 LA Taq酶0.5 μL，上、下游引物(100 μmol/L)各 1 μL，dNTPs(10 nmol/L)8 μL，10 × LA Buffer 10 μL，模板 cDNA 1 μL，加 ddH2O 至100 μL。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸70 s，30個循環(huán);72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.3 PCR產(chǎn)物克隆和鑒定 PCR產(chǎn)物膠回收后與克隆載體pGEM-T相連，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，將菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白色單克隆于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)6 h后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，酶切鑒定正確后測序以分析序列的正確性。

1.4 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Prdx1的構(gòu)建 將鑒定正確的pGEM-T-Prdx1質(zhì)粒與pGBKT7載體用EcoRⅠ和BamHⅠ分別雙酶切，將回收純化的酶切后片段連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒pGBKT7-Prdx1，測序。

1.5 誘餌質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

1.5.1 制備酵母感受態(tài)細(xì)胞 挑取酵母菌Y187和AH109的單克隆，接種于5 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，30℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)16～20 h(230～250 r/min)至光密度值(OD600nm)為 0.15 ～0.30 后，接種于50 mL YPDA液體培養(yǎng)基中，30℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.40～0.50(約3 h)。室溫下將酵母菌菌液以2700 r/min離心5 min。棄上清，加50 mL去離子水重懸沉淀，再次離心棄上清。用3 mL TE/LiAc溶液重懸，將重懸的酵母細(xì)胞分裝于1.5 mL 的離心管中，12000 r/min離心30 s，棄上清，加600 μL TE/LiAc重懸細(xì)胞，所得細(xì)胞懸浮液即為酵母感受態(tài)細(xì)胞。

1.5.2 誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌 在1.5 mL的離心管中加入 50 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞、0.5 μL誘餌質(zhì)粒、500 μL PEG/LiAc溶液與5 μL 鯡魚精 DNA，渦旋混勻。將離心管置于30℃水浴鍋中孵育30 min。向離心管中加入 20 μL DMSO，混勻，42℃孵育 20 min，每5 min混勻1次。將混合液2700 r/min離心5 min，棄上清，用1 mL YPDA液體培養(yǎng)基重懸沉淀，30℃孵育90 s，離心棄上清，用9 g/L的NaCl溶液輕輕重懸沉淀。將菌液均勻涂布于SD/-Trp固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3～5 d，直至長出單菌落。

1.6 自激活檢測 將轉(zhuǎn)有誘餌質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒的Y187和AH109酵母菌分別劃線于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-gal、SD/-Trp/-His/X-α-gal 以及 SD/-Trp/-Ade/X-α-gal固體培養(yǎng)基上。如果酵母菌株在SD/-Trp/-His/X-α-gal培養(yǎng)基上生長，則在酵母雙雜交篩選過程中需要加入組氨酸抑制劑3-AT以抑制組氨酸泄露。如果菌株在SD/-Trp/-Ade/X-α-gal培養(yǎng)基上生長，則誘餌蛋白對報告基因有自激活作用，不適合用酵母雙雜交的方法篩選相互作用蛋白。

1.7 毒性檢驗(yàn) 將含有誘餌質(zhì)粒的 Y187和AH109酵母菌菌株分別劃線于SD/-Trp固體培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)，挑取大小相近的克隆分別接種于SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)20 h，測 OD600nm。若含有誘餌質(zhì)粒的菌株OD600nm低于0.80，則說明誘餌蛋白的存在阻礙了酵母菌株的生長，該蛋白不適合用酵母雙雜交的方法篩選相互作用蛋白。

2 結(jié)果

2.1 DsPrdx1基因的克隆及鑒定 PCR擴(kuò)增所得片段長度約為600 bp(圖1)。提取質(zhì)粒pGEM-TPrdx1經(jīng)雙酶切后電泳顯示為兩條帶，一條約為3000 bp，為線性pGEM-T載體;另一條約為600 bp，為插入片段DsPrdx1(圖2)，測序后發(fā)現(xiàn)DsPrdx1無堿基突變和移碼突變，可用于構(gòu)建酵母雙雜交誘餌質(zhì)粒。

2.2 誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建及雙酶切鑒定 將pGBKT7-Prdx1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中并提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，電泳后顯示為兩條帶，一條約為7300 bp，為線性pGBKT7載體;另一條約為600 bp，為插入的DsPrdx1 cDNA片段(圖3)，對誘餌質(zhì)粒進(jìn)行測序表明DsPrdx1沒有發(fā)生突變，誘餌質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 DsPrdx1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 pGEMT-T-Prdx1雙酶切結(jié)果

圖3 誘餌質(zhì)粒雙酶切結(jié)果

2.3 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Prdx1的轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化pGBKT7-Prdx1的酵母細(xì)胞 Y187和 AH109的菌落PCR鑒定結(jié)果見圖4。

2.4 誘餌質(zhì)粒的自激活作用檢測 見表1。

2.5 誘餌蛋白的毒性檢測 將轉(zhuǎn)化有誘餌質(zhì)粒的Y187和AH109酵母菌接種于SD/-Trp液體培養(yǎng)基，30℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)20 h后測得OD600nm分別為1.199 和1.233，均大于0.80，表明誘餌蛋白對酵母菌Y187和AH109無毒性。

圖4 誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌菌落PCR鑒定

表1 誘餌載體的自激活作用檢測

3 討論

ROS(reactive oxygen species)過量積累會對細(xì)胞產(chǎn)生損傷[5]。Prdx1作為生物體內(nèi)廣泛存在的一種抗過氧化物酶，可以有效清除生物體內(nèi)產(chǎn)生的過量ROS;此外，Prdx1還具有信號傳導(dǎo)、分子伴侶等功能，并且參與了多種氧化相關(guān)的病理與生理過程[6-7]。有研究[3]表明 Prdx1存在于精細(xì)胞的尾部即鞭毛區(qū)域，但其在鞭毛中的功能尚不清楚。真核生物的鞭毛是一種細(xì)胞表面突起的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，主要由細(xì)胞微管組成[8]，在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、個體發(fā)育等過程中具有重要作用。鞭毛的組裝與去組裝過程伴隨細(xì)胞周期的進(jìn)行呈周期性動態(tài)，但是其生長調(diào)控機(jī)制尚不明確。杜氏鹽藻是一種單細(xì)胞真核藻類，具有等長雙鞭毛，因而非常適合作為研究鞭毛內(nèi)信號通路的模式生物。因此，用DsPrdx1作為誘餌釣取其相互作用蛋白的方法為進(jìn)一步研究Prdx1在鞭毛中的功能提供了可能。

酵母雙雜交技術(shù)是一種直接在真核活細(xì)胞內(nèi)檢測蛋白相互作用的方法[9]。酵母雙雜交系統(tǒng)不僅可以研究已知蛋白之間的相互作用，還可以發(fā)現(xiàn)與已知蛋白相互作用的未知蛋白。該實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了融合有DsPrdx1基因片段的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Prdx1，并將誘餌質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入酵母菌Y187和AH109中，通過毒性檢驗(yàn)證明了誘餌蛋白對酵母菌的生長沒有毒害作用。另外，假陽性的存在是酵母雙雜交的最大缺點(diǎn)，其主要原因是誘餌蛋白對報告基因的激活作用。該實(shí)驗(yàn)觀察了誘餌質(zhì)粒的自激活作用，結(jié)果表明誘餌蛋白對酵母菌AH109與Y187均無自激活作用，可以用于酵母雙雜交系統(tǒng)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為今后篩選DsPrdx1的相互作用蛋白奠定了基礎(chǔ)。

[1]Rhee SG，Chae HZ，Kim K.Peroxiredoxins:a historical overview and speculative preview of novel mechanisms and emerging concepts in cell signaling[J].Free Radic Biol Med，2005，38(12):1543

[2]Neumann CA，Cao J，Manevich Y.Peroxiredoxin 1 and its role in cell signaling[J].Cell Cycle，2009，8(24):4072

[3]O'flaherty C，de Souza AR.Hydrogen peroxide modifies human sperm peroxiredoxins in a dose-dependent manner[J].Biol Reprod，2011，84(2):238

[4]Singla V，Reiter JF.The primary cilium as the cell's anten-na:signaling at a sensory organelle[J].Science，2006，313(5787):629

[5]Lee KW，Lee DJ，Lee JY，et al.Peroxiredoxin Ⅱ restrains DNA damage-induced death in cancer cells by positively regulating JNK-dependent DNA repair[J].J Biol Chem，2011，286(10):8394

[6]Neumann CA，F(xiàn)ang Q.Are peroxiredoxins tumor suppressors? [J].Curr Opin Pharmacol，2007，7(4):375

[7]Jarvis RM，Hughes SM，Ledgerwood EC.Peroxiredoxin 1 functions as a signal peroxidase to receive，transduce，and transmit peroxide signals in mammalian cells[J].Free Radic Biol Med，2012，53(7):1522

[8]潘俊敏.衣藻、纖毛與“纖毛相關(guān)疾病”[J].中國科學(xué):C輯:生命科學(xué)，2008，38(5):399

[9]Fields S，Song O.A novel genetic system to detect proteinprotein interactions[J].Nature，1989，340(6230):245