楊雪蓮，張凱麗，李金玉，張秋晨，王成濤

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京100048）

3－甲硫基丙醇是多種發(fā)酵食品的主體風(fēng)味，廣泛應(yīng)用于香精香料調(diào)配和食品增香［1］.它有獨特的香味特征和低香氣閾值，是一類應(yīng)用非常廣泛的食用香料化合物，也是美國食用香料與提取物制造者協(xié)會公布的安全香料，且其市場需求日益增加［2－3］.然而，目前工業(yè)生產(chǎn)3－甲硫基丙醇的方法以化學(xué)法為主，雖然化學(xué)合成成本低廉，但存在諸多如原料毒性高、合成過程污染大、有毒副產(chǎn)物難于完全去除等問題［1，6］.

近年來，生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)香精香料已成為相關(guān)學(xué)者們研究的方向.利用微生物合成制備甲硫醇及其衍生香料不但安全、綠色、高效，而且在價格上具有明顯的優(yōu)勢，將會成為工業(yè)化生產(chǎn)甲硫醇類天然香料的理想途徑.目前，應(yīng)用酵母菌轉(zhuǎn)化3－甲硫基丙醇已有一些報道［2－6］.研究發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸代謝的一條支路生成了甲硫醇.Philippe等［2］認(rèn)為，該支路存在一種具有去甲硫基或者裂解甲硫基活性的酶，即cys3（EC4.4.1.1）基因編碼的胱硫醚－γ－裂解酶（cystathionineγ－lyase），它可能參與了從蛋氨酸至甲硫醇的分解代謝.因此，敲除掉釀酒酵母中有甲硫基裂解酶活性的cys3基因有助于提高釀酒酵母生產(chǎn)3－甲硫基丙醇的產(chǎn)率.本研究以實驗室前期構(gòu)建的敲除胱硫醚－γ－裂解酶基因cys3的基因工程菌株S288C－CYS3為基礎(chǔ)，通過單因素水平實驗和響應(yīng)面優(yōu)化實驗，獲得該工程菌代謝生產(chǎn)3－甲硫基丙醇的最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)，為工程菌的開發(fā)利用提供技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基與試劑

重組菌菌株S288C－CYS3由實驗室構(gòu)建并保藏.

種子培養(yǎng)基—YPD培養(yǎng)基（g／L）：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20.

發(fā)酵培養(yǎng)基（g／L）：蛋氨酸4.0，磷酸二氫鉀8.0，磷酸氫二鉀6.0，氯化鎂0.01，氯化亞鐵0.02，硫酸鋅0.03，酵母提取物0.8，葡萄糖30，氯化鈉2.0.

酵母提取物，G418，B.R，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；甲醇，色譜純，F(xiàn)isher Scientific；3－甲硫基丙醇，色譜純，Sigma；其他試劑均為分析純.

1.2 儀器設(shè)備

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化和培養(yǎng)

將保存于甘油管中的重組菌菌株S288C－CYS3經(jīng)活化傳代恢復(fù)活力后，轉(zhuǎn)接入種子培養(yǎng)基中，再以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度30℃，轉(zhuǎn)速200r／min，初始pH值5的條件下培養(yǎng)48h后取樣.

1.3.2 3－甲硫基丙醇含量檢測

培養(yǎng)結(jié)束后，收集發(fā)酵液于6 000r／min離心10min，取上清液留待產(chǎn)物檢測.采用高效液相色譜法（高效液相色譜儀型號Agilent 1100，色譜柱SepaxHP－C18（4.6mm×250mm）測定3－甲硫基丙醇的含量.色譜條件：流動相和甲醇－水的體積比為3∶7；流速1mL／min，30min；柱溫30℃；檢測波長215nm；進(jìn)樣量10μL［7］.

1.3.3 單因素實驗

以3－甲硫基丙醇產(chǎn)量作為評價指標(biāo)，對發(fā)酵溫度（25，30，35，40，45℃）、接種量（6%，8%，10%，12%，14%）、初始pH（4，5，6，7，8）、搖床轉(zhuǎn)速（120，160，200，240，280r／min）、發(fā)酵時間（12，24，36，48，60h）5個因素進(jìn)行單因素實驗篩選，分別考察各因素水平對重組菌產(chǎn)3－甲硫基丙醇的影響.

1.3.4 響應(yīng)面實驗設(shè)計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果選取因素水平，選取發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、pH值3個因素為自變量，以3－甲硫基丙醇的產(chǎn)量為響應(yīng)值，進(jìn)行Box－Behnken中心組合設(shè)計［9］，如表1所示.利用軟件Design Expert 8.05對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，檢驗擬合度和方差分析.最后討論預(yù)測模型的響應(yīng)面特征及其響應(yīng)值.

表1 實驗因素及編碼水平Tab.1 Design table of factors and levels

1.3.5 模型驗證

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化所得出的最優(yōu)發(fā)酵條件進(jìn)行重組菌S288C－CYS3發(fā)酵培養(yǎng)，測定3－甲硫基丙醇的產(chǎn)量，并比較模型預(yù)測值，以分析驗證模型的可靠性及實驗方案的最優(yōu)性.

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗數(shù)據(jù)取3次平行實驗的平均值.利用SAS 8.1及Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行實驗結(jié)果的顯著性分析和方差分析，并采用Design Expert 8.05軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析［10］.

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母工程菌產(chǎn)3－甲硫基丙醇的單因素實驗結(jié)果

分別考察不同溫度、轉(zhuǎn)速、初始pH值、接種量、發(fā)酵時間對3－甲硫基丙醇產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖1所示.

圖1 單因素對3－甲硫基丙醇（3－MTP）產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect single factor on 3－methylthio－propanol yield

由圖1a可知，3－甲硫基丙醇產(chǎn)量隨溫度的升高先升高后迅速降低，溫度為30℃時，產(chǎn)量最高，達(dá)到0.62g／L.溫度升高到45℃時，幾乎檢測不到3－甲硫基丙醇.圖1b中3－甲硫基丙醇產(chǎn)量隨初始pH值的增加先升高后降低.當(dāng)初始pH值大于5時，3－甲硫基丙醇的產(chǎn)量明顯下降.由圖1c可知，3－甲硫基丙醇的產(chǎn)量隨著發(fā)酵時間的延長而提高，48～60h時達(dá)到最大值，但這段時間增長速率緩慢，這可能是由于3－甲硫基丙醇是次級代謝產(chǎn)物，受到菌體自身調(diào)節(jié)機(jī)制的影響.方差分析顯示不同發(fā)酵溫度、初始pH值和發(fā)酵時間對該菌株產(chǎn)3－甲硫基丙醇的影響較為顯著（P＜0.01），所以選擇30℃、初始pH為5、發(fā)酵時間64h進(jìn)行響應(yīng)面實驗.

圖1d表明了不同轉(zhuǎn)速對3－甲硫基丙醇產(chǎn)量的影響.轉(zhuǎn)速低于200r／min時，隨著搖床轉(zhuǎn)速增加，發(fā)酵液流體湍動程度增大，氣相間的傳質(zhì)和液相中的傳質(zhì)過程加快，對菌體生長和產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化有利［8］，3－甲硫基丙醇產(chǎn)量逐漸提高.但攪拌過快，相應(yīng)的剪切力增加，對菌體有傷害，產(chǎn)量下降.圖1e可以看出，接種量為10%時3－甲硫基丙醇產(chǎn)量最高，接種量低于10%時，產(chǎn)物積累少；但接種量過大可能會引起菌體生長過快，發(fā)酵液黏度增加而造成溶氧不足［11］，反而影響了3－甲硫基丙醇的積累.研究表明，微生物生長到一定階段時，為適應(yīng)環(huán)境變化而產(chǎn)生了某些次級代謝產(chǎn)物，它們的合成受菌體細(xì)胞群體感應(yīng)調(diào)節(jié)［12］，3－甲硫基丙醇可能也屬于這類次級代謝產(chǎn)物.方差分析顯示不同轉(zhuǎn)速和接種量對該菌株產(chǎn)3－甲硫基丙醇的影響不顯著（P＞0.01）.因此，選擇搖床轉(zhuǎn)速200r／min，接種量為10%為最優(yōu)條件，在后期的響應(yīng)面優(yōu)化實驗中未進(jìn)一步考察.

2.2 酵母工程菌產(chǎn)3－甲硫基丙醇的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立

由圖1可知，對該基因工程菌轉(zhuǎn)化出3－甲硫基丙醇有顯著影響的因素有發(fā)酵溫度、初始pH、時間，其他因素對3－甲硫基丙醇產(chǎn)量影響不顯著.故選取此3個因素為自變量，3－甲硫基丙醇產(chǎn)量為響應(yīng)值，由Design Expert軟件設(shè)計出17組中心組合實驗方案［13］，實驗設(shè)計方案及結(jié)果如表2所示.

表2 中心組合實驗方案及結(jié)果Tab.2 Design and results of central composite test

采用Design Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到發(fā)酵時間（A）、發(fā)酵溫度（B）、初始pH值（C）之間的多項回歸方程為

2.2.2 回歸模型方差分析

對上述回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3.

表3 回歸方程方差分析結(jié)果Tab.3 Analysis of variances for the developed regression equation

分析表3的結(jié)果可知，回歸模型的顯著性很高（P＜0.000 1），而失擬項非顯著（P＝0.050 7＞0.05），說明參與響應(yīng)面優(yōu)化的考察因素設(shè)計合理，未知因素對3－甲硫基丙醇產(chǎn)量干擾很小.因此，不需要引入更高次數(shù)的項，模型適當(dāng)［10，14］.此外，模型的回歸方程與實際情況擬合度好（R2為0.985 6），這表明模型較準(zhǔn)確地反映了3－甲硫基丙醇的產(chǎn)量與培養(yǎng)基發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、pH值之間的關(guān)系，因此用該模型對釀酒酵母重組菌S288C－CYS3的培養(yǎng)條件進(jìn)行分析預(yù)測合理可行.F檢驗可用于判定各變量對響應(yīng)值影響的顯著性，P值越小顯著性越高［14－15］.表中由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗可知：模型中一次項A，B顯著（P＜0.01），C不顯著（P＞0.05）；二次項A2，B2，C2均處于顯著水平（P＜0.01）；交互項AB，AC，BC均不顯著（P＞0.05）.由于回歸方程一次項的回歸系數(shù)絕對值大小為A＞B＞C，所以，這3個因素對該菌代謝產(chǎn)3－甲硫基丙醇的影響大小依次為發(fā)酵時間＞發(fā)酵溫度＞初始pH.

2.2.3 響應(yīng)曲面圖及其等高線

釀酒酵母重組菌S288C－CYS3發(fā)酵溫度、時間、初始pH交互作用的響應(yīng)面曲線和等高線見圖2.

圖2直觀地反映了初始pH、時間和發(fā)酵溫度3因素與響應(yīng)值的對應(yīng)關(guān)系.在圖2中，不同因素交互效應(yīng)的強(qiáng)弱可以通過等高線的形狀進(jìn)行判定，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，圓形則表示兩因素交互作用不顯著［16－19］.所以，由圖2可知，發(fā)酵時間對響應(yīng)值的影響最大，發(fā)酵溫度的影響也較大，二者均表現(xiàn)為陡峭曲線，初始pH對響應(yīng)值影響最小，表現(xiàn)為平滑曲線［20］.分析模型的回歸方程可知，二次項系數(shù)（A2，B2，C2）分別為－0.091，－0.042，－0.026，均為負(fù)值，這意味著立體分析圖中的拋物面開口向下，極大值是存在的.根據(jù)軟件計算結(jié)果可知［21］，工程菌產(chǎn)3－甲硫基丙醇的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時間64.02h，發(fā)酵溫度30.99℃，初始pH值為5.09.在此條件下，3－甲硫基丙醇產(chǎn)量的預(yù)測值為0.698g／L.結(jié)合實際操作方便性和方差分析結(jié)果，確定最佳培養(yǎng)條件為發(fā)酵時間64h，發(fā)酵溫度為31℃，起始pH為5.

2.2.4 回歸模型的驗證

在最優(yōu)發(fā)酵條件下，重復(fù)3次搖瓶實驗以驗證預(yù)測值.實驗結(jié)果表明，3－甲硫基丙醇產(chǎn)量的平均值（0.690g／L）與模型預(yù)測值（0.698g／L）高度吻合，擬合率達(dá)98.85%.因此可以推測出，回歸模型可靠準(zhǔn)確.最終結(jié)果顯示，優(yōu)化后的3－甲硫基丙醇產(chǎn)量較之前提高了14.96%.

圖2 發(fā)酵溫度、時間、pH對3－甲硫基丙醇（3－MTP）產(chǎn)量影響的響應(yīng)面立體分析圖及等高線Fig.2 Response surface and contour plots for the effects of temperature，time and pH value on 3－methylthio－propanol productivity

3 結(jié)論

通過單因素實驗和響應(yīng)面優(yōu)化實驗對釀酒酵母重組菌S288C－CYS3發(fā)酵產(chǎn)3－甲硫基丙醇的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，建立了二次多項式回歸模型以表征目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量與初始pH、時間和發(fā)酵溫度3因素的關(guān)系，并驗證了模型的準(zhǔn)確性.最終得出釀酒酵母重組菌S288C－CYS3產(chǎn)3－甲硫基丙醇的最佳培養(yǎng)條件為發(fā)酵時間64h，發(fā)酵溫度31℃，起始pH值為5，接種量為10%，轉(zhuǎn)速為200r／min.在此條件下，3－甲硫基丙醇的產(chǎn)量高達(dá)0.690g／L，比發(fā)酵條件優(yōu)化前3－甲硫基丙醇的產(chǎn)量提高了14.96%.研究結(jié)果表明優(yōu)化方案的設(shè)計合理有效，能夠明顯提高釀酒酵母重組菌S288C－CYS3產(chǎn)3－甲硫基丙醇的產(chǎn)率.

［1] 孫寶國.食用調(diào)香術(shù)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：338－341.

［2] PERPETE P，DUTHOIT O，DE MAEYER S，et al.Methionine catabolism in Saccharomyces cerevisiae［J］.FEMS Yeast Research，2006，6（1）：48－56.

［3] HAZELWOOD L A，DARAN J M，VAN MARIS A J A，et al.The Ehrlich pathway for fusel alcohol production：a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism［J］.Applied and Environmental Microbiology，2008，74（8）：2259－2266.

［4] DEL CASTILLO－LOZANO M L，DELILE A，SPINNLER H E，et al.Comparison of volatile sulphur compound production by cheese－ripening yeasts from methionine and methionine－cysteine mixtures［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2007，75（6）：1447－1454.

［5] BUZZINI P，ROMANO S，TURCHETTI B，et al.Production of volatile organic sulfur compounds（VOSCs）by basidiomycetous yeasts［J］.FEMS Yeast Research，2005，5（4－5）：379－385.

［6] ETSCHM ANNM M W，KOTTER P，H AYF J，et a.l Production of the arom a chemica is 3－（methylthio）－1－propanol and 3－（methylthio）－propylacetate with yeasts［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2008，80：579－587.

［7] 溫明顯，王成濤，楊雪蓮，等.ARO10基因在Saccharomycescerevisiae中的克隆表達(dá)及其對3－甲硫基丙醇合成代謝的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38（4）：1－5.

［8] 徐春澤，王澤南，占子奇，等.響應(yīng)面法對產(chǎn)甘露醇發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］.現(xiàn)代食品科技，2012，28（2）：168－171.XU Chunze，WANG Zenan，ZHAN Ziqi，et al.Optimization of fermentation conditions for producing mannitol in lactobacillus fermentation by response surface methodology［J］.Modern Food Science and Technology，2012，28（2）：168－171.

［9] 王明艷，魯加峰，王曉順，等.響應(yīng)面法優(yōu)化天冬多糖的提取條件［J］.食品科學(xué)，2010（6）：91－95.WANG Mingyan，LU Jiafeng，WANG Xiaoshun，et al.Optimization of extraction of radix asparagi polysaccharides using response surface methodology［J］.Food Science，2010（6）：91－95.

［10] 劉國榮，張郡瑩，王成濤，等.響應(yīng)面法優(yōu)化彎曲乳桿菌RX－6代謝產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基組成［J］.食品科技，2013（3）：2－8.LIU Guorong，ZHANG Junying，WANG Chengtao，et al.Optimization of fermentation medium composition of Lactobacillus curvatus RX－6for bacteriocin production by response surface methodology［J］.Food Science and Technology，2013（3）：2－8.

［11] CHAVALPARIT O，ONGWANDEE M.Optimizing electrocoagulation process for the treatment of biodiesel wastewater using response surface methodology［J］.Journal of Environmental Sciences，2009，21（11）：1491－1496.

［12] 滿麗莉，孟祥晨，王輝，等.群體感應(yīng)系統(tǒng)在乳酸菌產(chǎn)細(xì)菌素中的作用［J］.食品科學(xué)，2011，32（13）：360－364.MAN Lili，MENG Xiangchen，WANG Hui，et al.Regulation ofBacteriocinsynthesis by quorum sensing in lactic acid bacteria：a review［J］.Food Science，2011，32（13）：360－364.

［13] XU C P，KIM S W，HWANG H J，et al.Optimization of submerged culture conditions for mycelial growthand exo biopolymer production by＜i＞Paecilomyces tenuipes＜／i＞C240［J］.Process Biochemistry，2003，38（7）：1025－1030.

［14] 王健.微量元素對厭氧污泥發(fā)酵產(chǎn)酸影響研究［D］.北京：中國地質(zhì)大學(xué)，2013.WANG Jian.Effects of trace metal elements on the production of volatile fatty acids from anaerobic sludge fermentation［D］.Beijing：China University of Geosciences，2013.

［15] 陳琳，孟祥晨.響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌代謝產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵條件［J］.食品科學(xué)，2011，32（03）：176－180 CHEN Lin，MENG Xiangchen.Optimization of fermentation conditions of lactobacillus plantarum for Bacteriocin production by response surface methodology［J］.Food Science，2011，32（03）：176－180

［16] 高飛虎，張玲，曾志紅，等.響應(yīng)面法優(yōu)化超微粉碎輔助提取辣椒紅素工藝研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，24（5）：1928－1933.GAO Feihu，ZHANG Ling，ZENG Zhihong，et al.Optimization on extraction technology of capsanthin by ultramicrofine comminution via response surface methodology［J］.Southwest China Journal of Agricultural Sciences，2011，24（5）：1928－1933.

［17] 閻娥，劉穎坤，劉建利，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化蠶豆殼中原花青素的微波提取工藝［J］.食品科技，2009（11）：163－167.YAN E，LIU Yingkun，LIU Jianli，et al.Optimization of microwave extraction for procyanidine from broad bean shell by response surface method［J］.Food Science，2009（11）：163－167.

［18] 宋江峰，李大婧，劉春泉.響應(yīng)曲面法優(yōu)選人工蛹蟲草多糖微波提取工藝［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，25（5）：1143－1150.SONG Jiangfeng，LI Dajing，LIU Chunquan.Optimization of microwave assisted extraction of cultured cordycepsmilitaris polysaccharide using response surface methodology［J］.Jiangsu J of Agr Sci，2009，25（5）：1143－1150.

［19] 王璐.基于棉籽油和文冠果油催化合成生物柴油研究［D］.石河子大學(xué)，2009.WANG Lu.Research of biodiesel preparation fromXanthocerassorbifoliakernel oil and cottonseed oil［D］.Shihezi University，2009

［20] 魏娜，羅敏，曾一梅，等.響應(yīng)面法優(yōu)化重組工程菌的發(fā)酵工藝條件［J］.生物技術(shù)，2010，20（4）：69－73.WEI Na，LUO Min，ZENG Yimei，et al.Optimization of fermentation conditions for genetically engineered bacterial using response surface methodology［J］.Biotechnology，2010，20（4）：69－73.

［21] 劉國榮，張郡瑩，王成濤，等.響應(yīng)面法優(yōu)化雙歧桿菌B04代謝產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵條件［J］.食品科學(xué)，2013，34（03）：147－152.LIU Guorong，ZHANG Junying，WANG Chengtao，et al.Optimization of fermentation conditions for bacterioc in production fromBifidobacteriumanimalB04by response surface methodology［J］.Food Science，2013，34（03）：147－152.