李 坤，肖四旺*，陳孟交，彭 文，董大立

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410005）

丹紫康膝沖劑對(duì)大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的影響

李 坤，肖四旺*，陳孟交，彭 文，董大立

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410005）

目的 探討丹紫康膝沖劑對(duì)大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡的影響。方法 將健康Wistar大鼠80只隨機(jī)分為4組，分別為丹紫康膝組，西藥組，模型組，正常組。除正常組外，其他組予以改良Hulth造模法造成大鼠膝骨性關(guān)節(jié)炎模型，于造模6周后對(duì)各組進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)4周后肉眼觀察大鼠膝關(guān)節(jié)大體形態(tài)，抽取關(guān)節(jié)液檢測(cè)一氧化氮（NO）含量，TUNEL法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 肉眼觀察下見(jiàn)模型組造模膝關(guān)節(jié)軟骨明顯退變，局部潰瘍，關(guān)節(jié)邊緣增生，正常組膝關(guān)節(jié)軟骨光滑潤(rùn)澤，丹紫康膝組和西藥組可見(jiàn)造模膝關(guān)節(jié)有新生軟骨生成；膝關(guān)節(jié)滑膜液NO含量正常組較其余3組低（P＜0.05），丹紫康膝組和西藥組NO含量較模型組低（P＜0.05）；丹紫康膝組和西藥組細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組（P＜0.05），丹紫康膝組、西藥組、模型組細(xì)胞凋亡率均較正常組高（P＜0.05）。結(jié)論 丹紫康膝沖劑能降低大鼠膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液NO含量，從而抑制由NO介導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡。

丹紫康膝沖劑；細(xì)胞凋亡；膝骨性關(guān)節(jié)炎；關(guān)節(jié)軟骨；一氧化氮

膝骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis of the knee，KOA)是以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹行?，伴隨關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生的一種退變性疾病。KOA的發(fā)病機(jī)制尚不明確，現(xiàn)代分子生物學(xué)研究表明[1]關(guān)節(jié)軟骨的破壞與軟骨細(xì)胞的過(guò)度凋亡有關(guān)，軟骨細(xì)胞的過(guò)度凋亡導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成所需的蛋白減少，從而破壞軟骨的增殖與降解之間的平衡。本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法，建立KOA大鼠模型，并以我院在臨床上療效明確的中成藥丹紫康膝沖劑進(jìn)行干預(yù)，探討丹紫康膝沖劑對(duì)KOA軟骨細(xì)胞過(guò)度凋亡的影響，為丹紫康膝沖劑治療KOA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和儀器

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)健康Wistar大鼠80只（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），許可證號(hào)：SCXK(湘)2009-0004，雌雄各半，體質(zhì)量（250±10）g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代購(gòu)，SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物和試劑

1.2.1 藥物 丹紫康膝沖劑：主要成分為紫河車、丹參、熟地黃、懷牛膝、補(bǔ)骨脂、巴戟天、桑寄生、土鱉、血竭、獨(dú)活、乳香、白芍。由湖南省中醫(yī)院藥劑科提供，6 g/包，成人1日劑量18 g；硫酸氨基葡萄糖片：0.314 g/片，成人每日劑量1.88 kg，批號(hào)（111001），新興同仁藥業(yè)有限公司。

1.2.2 試劑 凱基TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；大鼠一氧化氮（NO）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（上海豐翔生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器

光學(xué)顯微鏡：由上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)用光學(xué)儀器廠生產(chǎn)（型號(hào)MF528）；手外顯微手術(shù)器械一套：湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院手術(shù)室提供；RMZ23切片機(jī)，德國(guó)Leica。

2 方法

2.1 造模與評(píng)估

取健康Wistar大鼠80只，隨機(jī)選取雌雄各半共20只作為正常組，其余大鼠均復(fù)制Hulth模型，參考文獻(xiàn)方法造模[2]，術(shù)前對(duì)大鼠右后膝手術(shù)側(cè)備皮，于腹腔注射10%水合氯醛0.35 mL／100 g，將動(dòng)物麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，對(duì)大鼠右膝部絡(luò)合碘消毒3遍，消毒后予以鋪無(wú)菌巾，無(wú)菌條件下取右側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱切口長(zhǎng)約2 cm，暴露關(guān)節(jié)腔后切斷前交叉韌帶，完整切除內(nèi)側(cè)半月板，保留關(guān)節(jié)軟骨面，用絡(luò)合碘和生理鹽水交替沖洗傷口2遍，再用硫酸慶大霉素注射液8萬(wàn)U滴注浸潤(rùn)手術(shù)野，防止關(guān)節(jié)內(nèi)感染，然后用3-0的慕絲線逐層縫合切口，傷口不包扎，術(shù)后不固定患肢，置于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼養(yǎng)籠中允許其自由活動(dòng)及進(jìn)食，術(shù)后連續(xù)3 d每只手術(shù)大鼠予青霉素10萬(wàn)U肌肉注射，連續(xù)7 d對(duì)大鼠手術(shù)傷口予以絡(luò)合碘早晚消毒2次。術(shù)后所有造模動(dòng)物存活，所有造模動(dòng)物手術(shù)傷口未出現(xiàn)紅腫、化膿現(xiàn)象，所有造模大鼠手術(shù)傷口在術(shù)后8～10 d愈合，術(shù)后喂養(yǎng)6周即可得到大鼠KOA中期模型。

2.2 分組及給藥

將造模成功的大鼠隨機(jī)分為丹紫康膝組，西藥組，模型組，每組各20只。逐一對(duì)每只大鼠稱質(zhì)量，根據(jù)人與動(dòng)物體表面積換算公式計(jì)算每只大鼠每日給藥劑量，丹紫康膝組給予丹紫康膝沖劑（以蒸餾水溶解配制）1.67 g/(kg·d)灌胃，西藥組給予硫酸氨基葡萄糖片0.17 g/(kg·d)灌胃，正常組和模型組大鼠分別給予等體積生理鹽水灌胃，于連續(xù)給藥4周后觀察指標(biāo)。

2.3 標(biāo)本采集

藥物干預(yù)4周后，用1 mL注射器向大鼠膝關(guān)節(jié)注入1 mL生理鹽水并反復(fù)回抽，回抽后的液體經(jīng)離心取上清液，封存于-20℃待檢。大鼠處死后立即切開(kāi)右后膝關(guān)節(jié)腔，觀察關(guān)節(jié)軟骨面，依次標(biāo)號(hào)并詳細(xì)記錄關(guān)節(jié)大體形態(tài)，并用攝像機(jī)拍攝成像；剝?nèi)」晒莾?nèi)髁及脛骨平臺(tái)關(guān)節(jié)軟骨，切取后置10%甲醛液中固定，行TUNEL法檢測(cè)觀察關(guān)節(jié)軟骨凋亡細(xì)胞數(shù)。

2.4 指標(biāo)觀察與檢測(cè)

2.4.1 肉眼下關(guān)節(jié)大體觀察 觀察滑膜和軟骨表面的顏色、光澤、光滑度(是否粗糙)。按軟骨損傷分級(jí)法將軟骨退變程度分級(jí)[3]：0級(jí)正常；I級(jí)關(guān)節(jié)軟骨變?yōu)辄S白色，光澤差，表面仍較平滑；Ⅱ級(jí)在I級(jí)的基礎(chǔ)上出現(xiàn)潰瘍改變，潰瘍未及全層；Ⅲ級(jí)軟骨全層破壞，軟骨下骨暴露。

2.4.2 NO檢測(cè) 將大鼠膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液抽取離心保存后，保存于-20℃冰箱中，待檢測(cè)時(shí)取出解凍，并按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作要求檢測(cè)。

2.4.3 凋亡軟骨細(xì)胞觀察 采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)凋亡細(xì)胞，取“2.3”項(xiàng)下標(biāo)本切片按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，光鏡下以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒的細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，每只動(dòng)物隨機(jī)選取2張切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算出平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。并計(jì)算出陽(yáng)性細(xì)胞率(陽(yáng)性細(xì)胞率=視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)／視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù))。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

指標(biāo)數(shù)據(jù)均用“x±s”表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用單因素方差分析（滿足正態(tài)性），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 肉眼下關(guān)節(jié)大體觀察

正常組：關(guān)節(jié)軟骨表面光滑平整，無(wú)裂紋及軟化灶，呈淡藍(lán)色，潤(rùn)澤鮮艷，關(guān)節(jié)邊緣規(guī)則齊整，無(wú)骨贅形成，滑膜光滑呈絮狀白色，屬0級(jí)。模型組：關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，局部關(guān)節(jié)軟骨缺損，有骨唇及潰瘍樣改變，軟骨光澤暗淡，呈淡黃色，關(guān)節(jié)邊緣不規(guī)則，有明顯骨贅形成，關(guān)節(jié)周圍有纖維性粘連，結(jié)締組織增生明顯，部分關(guān)節(jié)有滑膜積液，滑膜增生明顯，或有關(guān)節(jié)變形，屬Ⅲ級(jí)。丹紫康膝組、西藥組：關(guān)節(jié)軟骨表面光滑或稍粗糙，色澤欠光亮，呈淡藍(lán)色或夾淡白色，關(guān)節(jié)面有修復(fù)痕跡，關(guān)節(jié)邊緣規(guī)則齊整，無(wú)骨贅形成，滑膜光滑，呈淡紅色，屬Ⅰ、Ⅱ級(jí)；見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)大體形態(tài)直觀圖

3.2 NO檢測(cè)

結(jié)果顯示正常組的NO釋放量較其他3組低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明造模成功；丹紫康膝組與西藥組NO釋放量差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P= 0.87＞0.05）；模型組NO釋放量較丹紫康膝組和西藥組高（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

3.3 凋亡軟骨細(xì)胞觀察

光鏡下觀察各組關(guān)節(jié)細(xì)胞凋亡情況 （見(jiàn)圖2），凋亡細(xì)胞結(jié)果顯示（見(jiàn)表1）正常組細(xì)胞凋亡率相對(duì)于其余3組細(xì)胞凋亡率明顯偏低（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；丹紫康膝組和西藥組比較，P值為0.284（P＞0.05），兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；丹紫康膝組、西藥組分別和模型組相比較，丹紫康膝組和西藥組細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組（P＜0.01），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 討論

KOA最主要的病變主要集中在關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨，而其主要病理特征是關(guān)節(jié)軟骨的退變，關(guān)節(jié)軟骨由軟骨基質(zhì)和軟骨細(xì)胞構(gòu)成，軟骨基質(zhì)的降解和軟骨細(xì)胞的減少共同構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨的退變。人體器官組織的正常形態(tài)和功能的維持依賴于細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡的平衡穩(wěn)定，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)KOA的發(fā)生與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的異常凋亡有關(guān)。Heraud等[4]通過(guò)TUNEL法檢測(cè)研究發(fā)現(xiàn)正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率很低(2%～5%)，而OA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡率則明顯升高 (達(dá)18%～21%)，說(shuō)明軟骨細(xì)胞凋亡參與了OA的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。OA軟骨細(xì)胞凋亡目前研究發(fā)現(xiàn)[5]主要由兩種途徑介導(dǎo)，一種是由NO介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制，另一種是由Fas介導(dǎo)的途徑，且兩種途徑相互獨(dú)立，互不干擾。NO是由NO限速酶一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸而生成，是細(xì)胞生長(zhǎng)分化過(guò)程中最重要的調(diào)節(jié)因子和信號(hào)傳導(dǎo)分子之一，可介導(dǎo)許多生物學(xué)現(xiàn)象[6]。Lotz[7]通過(guò)免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，正常成人關(guān)節(jié)軟骨不表達(dá)誘導(dǎo)型NOS(NOS的一種亞型)，而在OA關(guān)節(jié)軟骨中發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)型NOS強(qiáng)表達(dá)，其產(chǎn)生的NO一方面通過(guò)抑制蛋白聚糖的生物合成來(lái)抑制軟骨生成，另一方面又促使軟骨基質(zhì)的降解破壞關(guān)節(jié)軟骨。

丹紫康膝沖劑是我院治療KOA的經(jīng)驗(yàn)方，前期臨床觀察研究結(jié)果表明其治療KOA具有滿意的效果[8]，本課題的前期研究[9]亦表明丹紫康膝沖劑能改善軟骨中含水量，保護(hù)軟骨基質(zhì)中的羚脯氨酸，從而防治兔KOA的退變。任芳等[10]發(fā)現(xiàn)丹紫康膝沖劑可顯著提高SOD的活性，降低LPO含量，從而起到延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變，促進(jìn)軟骨修復(fù)的作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)進(jìn)行改良Hulth方法造成大鼠KOA模型，應(yīng)用丹紫康膝沖劑對(duì)造模大鼠KOA進(jìn)行干預(yù)，從大鼠KOA關(guān)節(jié)大體形態(tài)看，空白組大鼠關(guān)節(jié)完整光滑，造模組關(guān)節(jié)軟骨退化嚴(yán)重，而中藥組及西藥組軟骨形態(tài)較造模關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)完整；檢測(cè)大鼠膝關(guān)節(jié)液NO含量的表達(dá)量及軟骨細(xì)胞凋亡細(xì)胞的陽(yáng)性表達(dá)率，發(fā)現(xiàn)造模大鼠膝關(guān)節(jié)液NO含量明顯高于正常組（P＜0.05），造模大鼠軟骨細(xì)胞凋亡率亦明顯高于正常組（P＜0.01），而丹紫康膝組NO含量明顯低于模型組（P＜0.05），軟骨細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組（P＜0.01），實(shí)驗(yàn)表明丹紫康膝沖劑能抑制軟骨細(xì)胞凋亡，這可能是丹紫康膝沖劑通過(guò)抑制由NO介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡，從而延緩大鼠KOA的進(jìn)一步發(fā)展。

圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡光鏡圖（HE×400）

表1 4組大鼠關(guān)節(jié)液NO釋放量及軟骨細(xì)胞凋亡率（±s，n=20）

表1 4組大鼠關(guān)節(jié)液NO釋放量及軟骨細(xì)胞凋亡率（±s，n=20）

注：與正常組比較#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

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（本文編輯 楊 瑛）

Effects of Danzikangxi granules on the apoptosis of cartilage cells in rats with knee osteoarthritis

LI Kun,XIAO Siwang*,CHEN Mengjiao,PENG Weng,DONG Dali
（The Second Affiliated Hospital,Hunan University of CM,Changsha,Hunan 410005,China）

ObjectiveTo observe the effects of Danzikangxi granules on the apoptosis of cartilage cells in rats with knee osteoarthritis.MethodsHealthy Wistar rats were divided into 4 groups including Danzikangxigranules group (group a),western medicine group(group b),model group(group c)and blank control group(d).Group a,b and c were modeled knee osteoarthritis used improvable Hulth modeling method.6 weeks after modeled,each group was treated respectively.4 weeks after treatment,the general morphology of the knee joints were observed with naked eyes,the fluid in the knee joints was extracted and NO content was detected, the apoptosis rates of the joint chondrocytes were detected using TUNEL.Results After modeled,knee cartilage was obviously degenerated,appeared local ulcer and joint marginal hyperplasia with naked eyes;knee cartilages of blank group were smooth and moist;new cartilage of knee joints were generated in Danzikangxi group and western medicine group.NO contents of the knee synovial fluid in normal group were lower than the other 3 groups(P＜0.05);NO contents of the Danzikangxi group and the western medicine group were lower than that of the model group (P＜0.05);the apoptosis rates of the Danzikangxi group and the western medicine group were obviously lower than that of model group(P＜0.05);the apoptosis rates of the Danzikangxi group, the western medicine group and the model group were higher than that of the blank group(P＜0.05). Conclusion Danzikangxi granules can reduce the NO content of synovial fluid of the rat knee joint, and thus inhibit the joint chondrocyte apoptosis.

Danzikangxi granules;apoptosis;knee osteoarthritis;articular cartilage;NO

R285.5；R684

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2014.03.006.020.04

2013-10-27

湖南省中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目(2010015)。

李 坤，男，在讀碩士研究生，研究方向：骨關(guān)節(jié)病變的研究。

*肖四旺，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：xedu@126.com。

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