尤冬春 ，謝義松 *，肖四旺，朱建華 ，陳孟交 ，孫國(guó)榮 ，鄭先波

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410005）

骨質(zhì)疏松癥屬于中醫(yī)學(xué)的 “骨痹”、“骨痿”、“骨縮病”等范疇，是最常見(jiàn)的老年性疾病之一，嚴(yán)重影響著老年人的生活質(zhì)量，所以骨質(zhì)疏松的防治已成為當(dāng)今的醫(yī)學(xué)熱點(diǎn)之一[1]。根據(jù)中醫(yī)“腎主骨”的理論，臨床上采用補(bǔ)益肝腎、健脾益氣的治法組方治療骨質(zhì)疏松癥及相關(guān)并發(fā)癥取得了較好的療效。本實(shí)驗(yàn)采用卵巢切除所誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠為模型，通過(guò)觀察虎潛丸干預(yù)對(duì)去卵巢大鼠骨密度及骨組織形態(tài)的影響，為其防治骨質(zhì)疏松提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 6個(gè)月齡大SPF級(jí)雌性SD大鼠40只，體質(zhì)量200～250 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2011-0003。

1.1.2 藥物 虎潛丸由酒炒黃柏、酒炙龜甲、酒炒知母、熟地黃、陳皮、白芍、鎖陽(yáng)、炙狗骨(替代虎骨)、干姜9味中藥組成，其提取的藥物，含生藥量0.35 kg/L(由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室提供)；雌激素尼爾雌醇片由上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：1 mg/片，批號(hào)：961001。

1.1.3 儀器 雙能X線骨密度測(cè)量?jī)x，美國(guó)HOLOGIc公司產(chǎn)品，QDR4000型；JY3002型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；LEICA DM LB2型雙目顯微鏡，德國(guó)LEICA公司產(chǎn)；Motic B5顯微攝像系統(tǒng)，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司；S2-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器，上海亞榮生化儀器廠；Shandon325型石蠟切片機(jī)，英國(guó)Shandon公司產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 所有SD大鼠喂養(yǎng)在恒溫、恒濕的清潔環(huán)境中，環(huán)境溫度為（25±1）℃，濕度為70%，每天12 h光照/黑暗，進(jìn)食大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料和凈化水。飼養(yǎng)1周后，將40只大鼠隨機(jī)分為模型組、雌激素組、虎潛丸組和假手術(shù)組，每組10只。

1.2.2 造模[2]采用10%水合氯醛溶液對(duì)SD大鼠按0.33 mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射進(jìn)行麻醉。麻醉生效后，手術(shù)組大鼠采用背側(cè)入路（肋弓下第3腰椎旁開(kāi)0.5 cm處）摘除雙側(cè)卵巢造模，假手術(shù)組采用相同入路僅切除卵巢周?chē)倭恐窘M織。切口內(nèi)滴入少量青霉素水溶液，分層縫合手術(shù)切口。術(shù)后分籠飼養(yǎng)，用80 U單位青霉素注射液腹腔注射3 d抗感染。

1.2.3 給藥劑量及方法 術(shù)后4周，從造模組及假手術(shù)組中隨機(jī)各選出5只大鼠行活體骨密度檢查，以確定造模成功。在確定造模成功后，各組大鼠進(jìn)行灌胃給藥治療，灌胃給藥容積為20 mL/（kg·d），虎潛丸組給予虎潛丸煎劑濃縮液按 7 g/（kg·d）灌胃，藥物以蒸餾水定容至所需濃度，每日1次；雌激素組給予尼爾雌醇 1 mL/（kg·d）灌胃，使用前配成混懸液(濃度為 0.167 mg/mL)，1 次/周，其余時(shí)間予蒸餾水20 mL/（kg·d）灌胃。假手術(shù)組及模型組給予蒸餾水按20 mL/（kg·d）灌胃。灌胃中雌激素組與虎潛丸組各死亡1只。灌胃12周后斷頭處死各組大鼠，取出各組大鼠脊柱骨、一側(cè)股骨。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 骨密度測(cè)量 采用雙能X線骨密度測(cè)量?jī)x測(cè)定大鼠的全身骨密度、全部腰椎骨密度（由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供儀器）。

1.3.2 病理組織學(xué)觀察 將剝離的大鼠股骨脫鈣、石蠟切片、HE染色后，顯微鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 16.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用“”表示，符合正態(tài)分布及方差齊性行方差分析（ANOVA），方差不齊者采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠骨密度比較

干預(yù)12周后，模型組大鼠的骨密度低于假手術(shù)組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明骨質(zhì)疏松大鼠模型已建立?；撏杞M及雌激素組大鼠骨密度均高于模型組，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明兩種治療方式均有治療效果；虎潛丸組與雌激素組大鼠骨密度相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組骨密度比較見(jiàn)表1。

表1 治療12周后各組大鼠骨密度的比較 g/cm2）

表1 治療12周后各組大鼠骨密度的比較 g/cm2）

注：與模型組比較*P＜0.05；與假手術(shù)模型組比較#P＜0.05。

組 別假手術(shù)組模型組雌激素組虎潛丸組例數(shù)10 10 9 9全身骨密度0.129±0.014 0.115±0.009#0.128±0.011*0.127±0.013*腰椎骨密度0.205±0.034 0.171±0.036#0.205±0.030*0.210±0.028*

2.2 對(duì)去卵巢大鼠股骨病理組織的影響

模型組大鼠股骨干髓端病理切片檢查顯示骨小梁稀疏、斷裂，排列紊亂，骨皮質(zhì)疏松，呈蠶食樣及蔥皮樣改變，骨髓腔擴(kuò)大。假手術(shù)組骨皮質(zhì)可見(jiàn)少許蠶食樣改變，骨小梁較細(xì)，排列較為一致?；撏杞M及雌激素組骨組織病理切片均示骨小梁較粗，排列整齊，骨髓腔大小正常，骨皮質(zhì)致密，邊緣整齊。提示虎潛丸及雌激素可以明顯改善去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨組織顯微結(jié)構(gòu)的病理變化。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠股骨切片顯微觀察圖（HE染色×40）

3 討論

切除卵巢的大鼠是研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制和觀察藥物療效的成熟的動(dòng)物模型[2]，而骨密度測(cè)定是研究骨質(zhì)疏松和評(píng)價(jià)藥效的重要手段，被認(rèn)為是目前骨質(zhì)測(cè)量的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3]。本次實(shí)驗(yàn)中，造模4周后手術(shù)組的骨密度呈下降趨勢(shì)，從而確定造模成功。整個(gè)生命活動(dòng)中骨都具有新陳代謝的活性。破骨細(xì)胞不斷的清除舊的礦物質(zhì)，與此同時(shí)成骨細(xì)胞形成類(lèi)骨質(zhì)并礦化[4]。成骨細(xì)胞的產(chǎn)生是體內(nèi)多種調(diào)控因素作用的結(jié)果，有研究表明雌激素作用于成骨細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子及基質(zhì)金屬蛋白酶，進(jìn)而影響破骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化，維持其骨密度[5]。骨顯微結(jié)構(gòu)和骨密度改變是評(píng)價(jià)骨強(qiáng)度變化的指標(biāo)[6]，實(shí)驗(yàn)中觀察到模型組大鼠骨小梁完整性差、斷裂，骨密度降低，符合骨質(zhì)疏松癥模型?；撏杞M和雌激素組大鼠骨小梁排列較整齊，連接成網(wǎng)，面積、密度無(wú)明顯減少，表明虎潛丸和雌激素對(duì)去卵巢大鼠骨量的丟失，有一定的預(yù)防效果。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中可以看出虎潛丸能提高去卵巢大鼠的骨密度，且對(duì)骨組織的影響與雌激素組十分相似，其機(jī)制是虎潛丸中的有效成分，作用于成骨細(xì)胞，使其增殖、分化和代謝，并促使成骨細(xì)胞合成、分泌多種蛋白質(zhì)和調(diào)節(jié)因子，從而引起局部類(lèi)骨質(zhì)礦化，起到維持骨代謝平衡的作用。

虎潛丸方是補(bǔ)腎經(jīng)典方，根據(jù)中醫(yī)標(biāo)本兼治的原則建立，有滋陰降火、強(qiáng)壯筋骨的功效，主治精血不足，筋骨痿弱。方中黃柏、龜板、知母、熟地黃滋補(bǔ)肝腎，壯腎水而滋陰；陳皮、白芍、鎖陽(yáng)、虎骨（現(xiàn)以狗骨代替）、干姜補(bǔ)腎強(qiáng)筋壯骨，兼理氣和中，使補(bǔ)而不滯。現(xiàn)代藥理研究表明，虎潛丸有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗疲勞等作用，可以促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，可有效地治療骨質(zhì)疏松癥[7]。也有研究表明[8]，虎潛丸提高了腎虛患者的骨密度，且骨密度的升高與調(diào)節(jié)皮質(zhì)醇、性激素有關(guān)。

中藥虎潛丸治療去卵巢大鼠后，骨密度較治療前顯著增加，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了中藥虎潛丸的療效。但虎潛丸治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制在本實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有涉及，只能初步推測(cè)可能與雌激素的作用機(jī)制相關(guān)，擬在下一步實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

[1]李晴晴，潘智敏.原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中醫(yī)病變機(jī)制的研究進(jìn)展[J].浙江中醫(yī)雜志，2010，45(2)：147-149.

[2]李 昊，張西正.小鼠骨質(zhì)疏松模型建立方法與評(píng)價(jià)指標(biāo)選擇概述[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2012，18(7)：663-666.

[3]遇呈祥，陳 亮，宴錚劍，等.骨密度對(duì)骨質(zhì)疏松性骨折的判斷價(jià)值[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2012，18(2)：127-129.

[4]曾 英，莫新民，雷曉明，等.壯骨止痛膠囊對(duì)去卵巢雌鼠骨質(zhì)疏松癥骨密度及相關(guān)生化指標(biāo)的影響 [J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，28(2)：10-12.

[5]劉紅光，區(qū)品中，吳波以，等.雌激素及雄激素對(duì)去睪丸大鼠骨質(zhì)疏松形成的干預(yù)研究[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2003，9(2)：97-101.

[6]胡斌麗，劉 巍，黎 英，等.大豆膳食對(duì)去卵巢大鼠骨密度及骨病理形態(tài)學(xué)作用的實(shí)驗(yàn)性研究[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，28(3)：222-224.

[7]陳德強(qiáng)，劉鵬飛，王 鑫.虎潛丸對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖及分化的影響[J]. 山東中醫(yī)雜志，2012，31(1)：50-54.

[8]劉立軍，丁學(xué)賓，安占坡，等.虎潛丸配合骶管沖擊治療腰椎間盤(pán)突出癥術(shù)后 42 例[J]. 河北中醫(yī)，2008，30(10)：1 050-1 051.