油菜籽粒發(fā)育過(guò)程中脂肪酸累積模式及相關(guān)分析

劉 念， 范其新， 蒙大慶， 湯天澤， 李芝凡， 李迎春， 謝卓霖

(綿陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，四川 綿陽(yáng) 621023)

油菜是中國(guó)重要的油料作物，也是中國(guó)主要食用油來(lái)源，它的重要性越來(lái)越被人們所重視［1-4］。中國(guó)油菜常年種植面積和總產(chǎn)都居世界第一位，總面積為世界油菜面積的23.4%，總產(chǎn)為世界油菜總產(chǎn)的22.6%［5］。中國(guó)油菜主要分為食用油菜和工業(yè)油菜，其籽粒脂肪酸主要成分為棕櫚酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、芥酸等，其中食用油菜籽粒的主要營(yíng)養(yǎng)成分是油酸與亞油酸［6］。人體自身無(wú)法合成亞油酸與亞麻酸，必須從外界攝入。亞油酸易被人體消化吸收，能夠降低體內(nèi)血清膽固醇和甘油三酯含量，具有軟化血管、阻止血栓形成等作用。油酸具有減少血漿中低密度脂蛋白膽固醇含量，預(yù)防及治療動(dòng)脈硬化的作用，而且在純化、儲(chǔ)存和加熱過(guò)程中不易氧化［7-8］。所以油菜育種的一個(gè)重要目標(biāo)就是提高食用菜籽油中油酸的含量。長(zhǎng)鏈脂肪酸芥酸在人體中碳鏈消化率低，并且實(shí)驗(yàn)證明它容易誘發(fā)冠心病、脂肪肝等疾?。?］。從營(yíng)養(yǎng)價(jià)值來(lái)說(shuō)，芥酸對(duì)人體和動(dòng)物體十分不利。從工業(yè)用途來(lái)說(shuō)，芥酸是重要的工業(yè)原料。芥酸及其衍生物廣泛應(yīng)用于化工行業(yè)，除用作溶劑和潤(rùn)滑劑外，還是香料、化妝品、油漆等化學(xué)用品的原料。另外高芥酸含量的菜籽油可以直接作為柴油機(jī)燃料，被稱為二十一世紀(jì)的化工原料［9-11］。

在植物中，低于18碳(18C)的脂肪酸合成是在質(zhì)體中進(jìn)行的。在種子里，脂肪酸的合成是在未分化的質(zhì)體中進(jìn)行的。脂肪酸從頭合成系統(tǒng)產(chǎn)生鏈長(zhǎng)18C以下的飽和脂肪酸，如棕櫚酸和硬脂酸;超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成系統(tǒng)合成鏈長(zhǎng)18C以上的脂肪酸，如二十碳烯酸和芥酸;脂肪酸去飽和系統(tǒng)在去飽和的作用下產(chǎn)生不飽和脂肪酸，如油酸、亞油酸和亞麻酸。乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)基因(bccp等)、脂肪酸延長(zhǎng)酶基因(fae1)和脂肪酸脫氫酶基因(fad2)分別是以上3個(gè)系統(tǒng)中調(diào)控脂肪酸合成的關(guān)鍵基因［12］。前人對(duì)油菜種子發(fā)育過(guò)程中脂肪酸合成代謝途徑已有較多的研究，了解油菜籽粒發(fā)育過(guò)程中不同脂肪酸的累積模式及其相互關(guān)系對(duì)于定向調(diào)控油菜種子的脂肪酸組成具有十分重要的理論和實(shí)踐意義。本試驗(yàn)利用近幾年選育的雙低和特高芥酸油菜品種，探索高、低芥酸品種中脂肪酸累積模式，并對(duì)各脂肪酸含量進(jìn)行相關(guān)分析，為高、低芥酸油菜產(chǎn)量提高、品質(zhì)改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

低芥酸油菜品種綿油88(種子芥酸含量0.58%，含油率39.08%)和高芥酸品種綿油309(種子芥酸含量55.15%，含油率42.86%)，由綿陽(yáng)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院選育與提供，于2011年9月播種在四川省綿陽(yáng)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院內(nèi)。油菜開(kāi)花期間在大田選擇發(fā)育一致的植株，標(biāo)記主花序和第一分枝花序上同一天開(kāi)的花，開(kāi)花10 d后每5 d取1次莢，開(kāi)花后50 d最后1次取莢，共取9次。標(biāo)記時(shí)間和日期，陽(yáng)光下曬干，常溫保存。

1.2 試驗(yàn)方法

參照國(guó)標(biāo)(GB/T 17377-1998動(dòng)植物油脂脂肪酸甲酯的氣相色譜分析)［13］，將油菜籽粉碎，每份樣品取0.5 g左右，3次重復(fù)，放入10 ml的離心管中，加入石油醚-乙醚混合液2.0 ml，加蓋過(guò)夜。再加入KOH-甲醇溶液1.5 ml，充分混勻，靜置 2～3 h，加蒸餾水定容至10.0 ml。約0.5 h后吸取上清液(＞0.5 ml)移至2.0 ml樣品瓶中，然后置于百位進(jìn)樣盤(pán)中，經(jīng)自動(dòng)進(jìn)樣器(Agilent Ge Injector)轉(zhuǎn)入色譜柱，進(jìn)行色譜分析。

氣相色譜法測(cè)定油菜籽粒中脂肪酸的含量，儀器型號(hào)為Agilent7890-GC。分析條件:入口溫度260℃，入口壓強(qiáng)172 kPa，柱內(nèi)平均流速42 cm/s，柱內(nèi)流量1.5 ml/min，氫氣流量40 ml/min，空氣流量400 ml/min，氮?dú)饬髁?25 ml/min，一次上樣體積1.0μl，分流比100∶1。脂肪酸成分以標(biāo)準(zhǔn)品與樣品中脂肪酸的相對(duì)保留時(shí)間來(lái)定性，面積歸一化法進(jìn)行定量［13-14］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

氣相色譜分析結(jié)果以12種脂肪酸的絕對(duì)含量(mg/g)和相對(duì)含量(%)表示。依據(jù)12種脂肪酸的量計(jì)算脂肪酸總量(mg/g)。脂肪酸絕對(duì)含量計(jì)算公式為Ki=Ai×ms/(As×m)，其中Ai為第i種脂肪酸組分的峰面積，As為內(nèi)標(biāo)的峰面積，ms為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量，m為樣 品 干 質(zhì) 量［15］。相 對(duì) 含 量(%)=Ai/∑Ai×100%。重復(fù)3次。采用Microsoft Office Excel 2003作圖，利用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 油菜籽粒成熟過(guò)程中棕櫚酸含量的變化

由圖1可以看出，綿油88和綿油309在開(kāi)花后第10 d就能檢測(cè)到大量的棕櫚酸，在第15 d其含量達(dá)到最大值，分別是19.178%和22.032%。說(shuō)明棕櫚酸在授粉后就大量累積，之后含量不斷緩慢下降，在開(kāi)花后第25 d到第50 d含量變化很小，綿油88和綿油309含量分別下降了1.369%和1.422%。在開(kāi)花后10 d到15 d綿油88中的棕櫚酸含量都是低于綿油309的，在第20 d后綿油88中棕櫚酸的含量高于綿油309，這與油菜品種中脂肪酸的去飽和酶含量和活性有關(guān)。總起來(lái)看，這兩個(gè)品種棕櫚酸的累積模式基本一致。

圖1 油菜籽粒發(fā)育過(guò)程中棕櫚酸積累動(dòng)態(tài)Fig.1 Dynamic change of the palm itic acid content during rapeseed development

2.2 油菜籽粒成熟過(guò)程中油酸含量的變化

開(kāi)花后第10～25 d，綿油88的油酸含量就快速上升，從10.247%升到54.640%，然后進(jìn)入一個(gè)緩慢上升的平臺(tái)期;綿油309從開(kāi)花第10～15 d油酸含量有所下降，之后快速上升到達(dá)峰值28.462%，然后又緩慢的下降至最低值13.796%(圖2)。在開(kāi)花后20 d內(nèi)，高、低芥酸品種中的油酸含量差異不大，但是在開(kāi)花25 d后含量差異明顯，高芥酸品種油酸含量低，低芥酸品種油酸含量高。

圖2 油菜籽粒發(fā)育過(guò)程中油酸酸積累動(dòng)態(tài)Fig.2 Dynamic change of the oleic acid content during rapeseed development

2.3 油菜籽粒成熟過(guò)程中亞油酸含量的變化

從圖3可以看出，綿油88和綿油309在開(kāi)花后第10 d就能檢測(cè)到大量的亞油酸。綿油88隨著時(shí)間的推移，亞油酸含量不斷下降，開(kāi)花后第10～25 d快速下降，之后進(jìn)入一個(gè)平臺(tái)期;綿油309在第10～15 d亞油酸含量有少量累積，然后快速下降，第25 d后也是一個(gè)平臺(tái)期?？傮w上看，在高、低芥酸品種中，亞油酸的累積模式基本一致。

圖3 油菜籽粒發(fā)育過(guò)程中亞油酸積累動(dòng)態(tài)Fig.3 Dynamic change of the linoleic acid content during rapeseed development

2.4 油菜籽粒成熟過(guò)程中亞麻酸含量的變化

綿油88在開(kāi)花后第10 d就可以檢測(cè)到大量的亞麻酸(含量25.317%)，之后進(jìn)入一個(gè)快速下降期，在第25 d后，含量變化不大;綿油309在開(kāi)花后第20 d前亞麻酸含量明顯低于綿油88，綿油309的亞麻酸累積過(guò)程較綿油88平穩(wěn)，含量在8.008%至12.975%之間(圖4)。

圖4 油菜籽粒發(fā)育過(guò)程中亞麻酸積累動(dòng)態(tài)Fig.4 Dynamic change of the linolenic acid content during rapeseed development

2.5 油菜籽粒成熟過(guò)程中花生烯酸含量的變化

從圖5可以看出在綿油88中，花生烯酸的合成明顯受阻，含量很少。但是在高芥酸品種綿油309中從開(kāi)花后第15 d開(kāi)始含量就逐漸上升，在第25 d時(shí)到達(dá)峰值(9.619%)，之后進(jìn)入平臺(tái)期，在開(kāi)花第40 d后含量又開(kāi)始下降，成熟時(shí)的含量是5.377%，其合成規(guī)律可以基本概括為“升-平-降”。

2.6 油菜籽粒成熟過(guò)程中芥酸含量的變化

圖5 油菜籽粒發(fā)育過(guò)程中花生烯酸積累動(dòng)態(tài)Fig.5 Dynamic change of the eicosenoic acid content during rapeseed development

綿油88的芥酸含量很低(圖6)，說(shuō)明在低芥酸品種中，芥酸的合成途徑是受阻的。在綿油309中從開(kāi)花后第10 d開(kāi)始就快速合成芥酸，其含量一直處于累積的過(guò)程，其中第15～30 d、第40～50 d這2個(gè)時(shí)期合成較快，可以推測(cè)在高芥酸品種油菜綿油309中芥酸有2個(gè)快速合成期，這與前人的研究結(jié)果［16］一致。

圖6 油菜籽粒發(fā)育過(guò)程中芥酸積累動(dòng)態(tài)Fig.6 Dynamic change of the erucic acid content during rapeseed development

2.7 油菜籽粒發(fā)育過(guò)程中主要脂肪酸含量間相關(guān)性分析

表1列出了綿油88和綿油309種子發(fā)育過(guò)程各種主要脂肪酸百分含量之間的相關(guān)系數(shù)。高、低芥酸品種中棕櫚酸含量與油酸含量呈負(fù)相關(guān)，這可能與棕櫚酸是油酸合成的前體有關(guān)。棕櫚酸含量與花生烯酸含量、芥酸含量呈負(fù)相關(guān)，與亞麻酸含量呈顯著正相關(guān)。棕櫚酸含量與亞油酸含量在高、低芥酸品種中相關(guān)性相反，在高芥酸品種中呈顯著正相關(guān)，在低芥酸品種中呈顯著負(fù)相關(guān)。油酸含量與亞油酸含量和亞麻酸含量呈負(fù)相關(guān)，與花生烯酸含量和芥酸含量呈正相關(guān)。在高芥酸品種中，油酸含量與亞油酸、亞麻酸含量相關(guān)性較低，相關(guān)系數(shù)分別是-0.356、-0.127;與花生烯酸含量的相關(guān)性較高，為0.549，可能在高芥酸品種中脂肪酸延長(zhǎng)酶基因(fae1)的活性較高，脂肪酸主要向碳鏈延長(zhǎng)方向轉(zhuǎn)化。在低芥酸品種中，油酸含量與亞油酸、亞麻酸含量的相關(guān)系數(shù)高，分別是-0.997＊＊和-0.912＊＊(P＜0.01)，與花生烯酸含量的相關(guān)性低。

2.8 高、低芥酸油菜脂肪酸合成過(guò)程中油酸含量/亞油酸含量比值、油酸含量/花生烯酸含量比值分析

2個(gè)品種脂肪酸合成過(guò)程中油酸含量/亞油酸含量比值、油酸含量/花生烯酸含量比值隨時(shí)間的變化分別見(jiàn)表2和表3。油酸含量/亞油酸含量比值綿油88明顯高于綿油309，相關(guān)系數(shù)是0.815＊＊(P＜0.01)，達(dá)到極顯著水平;亞油酸含量/花生烯酸含量比值中綿油88也明顯高于綿油309，相關(guān)系數(shù)是-0.765＊＊(P＜0.05)，達(dá)到顯著水平。

表1 油菜籽粒發(fā)育過(guò)程中主要脂肪酸含量間的相關(guān)系數(shù)Table 1 Correlation coefficients between main fatty acids contents during rapeseed development

表2 油菜脂肪酸合成過(guò)程中油酸含量/亞油酸含量比值的變化Table 2 The change of oleic acid/linoleic acid ratio during systhesis of fatty acid of rapeseed

表3 油菜脂肪酸合成過(guò)程中油酸含量/花生烯酸含量比值的變化Table 3 The change of oleic acid/eicosenoic acid ratio during systhesis of fatty acid of rapeseed

3 討論

脂肪酸組成是決定食用油品質(zhì)的重要因素，油菜中脂肪酸主要成分是棕櫚酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、芥酸等，在不同的油菜品種中各種脂肪酸的相對(duì)比例不同。高、低芥酸油菜品種在脂肪酸積累過(guò)程中，棕櫚酸、亞油酸、亞麻酸積累模式基本一致，油酸、花生烯酸、芥酸的累積方式上差異較大。在高芥酸品種中，油酸與亞油酸、亞麻酸相關(guān)性較低，與花生烯酸的相關(guān)性較高。在低芥酸品種中，油酸與亞油酸、亞麻酸的相關(guān)性較高，與花生烯酸的相關(guān)性較低?？赡茉诘徒嫠崞贩N中fad2(脂肪酸脫氫酶2)的活性較高，脂肪酸在脫氫酶的作用下完成去飽和作用［17］。這也在一定程度上說(shuō)明油酸處于脂肪酸延長(zhǎng)系統(tǒng)和去飽和系統(tǒng)的交叉點(diǎn)［18］。

本研究分析了油酸含量/亞油酸含量比值、油酸含量/花生烯酸含量比值，高低芥酸品種相關(guān)系數(shù)都達(dá)到極顯著水平，這說(shuō)明芥酸合成量在高、低芥酸品種間相對(duì)穩(wěn)定，并對(duì)油酸向亞油酸、油酸向花生烯酸轉(zhuǎn)化量的影響較小。油酸處于2條路徑的交叉點(diǎn)，分別向亞油酸和花生烯酸轉(zhuǎn)化，高、低芥酸品種中由于脂肪酸延長(zhǎng)和去飽和的酶活性和底物不一樣，造成了油菜品種中芥酸合成的差異。這也說(shuō)明了培育高、低芥酸油菜的可能性。

前人研究結(jié)果表明，脂肪酸的合成受各種酶的調(diào)控，種子脂肪酸累積過(guò)程中主要受fae1、fad2的影響。不同的脂肪酸在不同時(shí)期含量不同，其規(guī)律主要表現(xiàn)為酶活性與底物特異性。在綿油88中，授粉前20 d，油酸增加，亞油酸、亞麻酸減少，說(shuō)明此時(shí)控

制油酸向亞油酸轉(zhuǎn)化的fad2活性很小，授粉后第20～25 d棕櫚酸、亞油酸、亞麻酸含量下降，油酸、花生烯酸含量增加，說(shuō)明這個(gè)階段fae1的活性比f(wàn)ad2的活性高，主要是向脂肪酸碳鏈延長(zhǎng)的方向轉(zhuǎn)化。在綿油309中，授粉后前15 d以亞油酸合成量增加和油酸合成量下降為主，說(shuō)明此時(shí)控制油酸向亞油酸轉(zhuǎn)化的fad2活性很大，并且亞油酸的合成底物是油酸;授粉后第15～20 d，油酸含量開(kāi)始增加，同時(shí)棕櫚酸含量開(kāi)始下降，說(shuō)明此時(shí)控制棕櫚酸向油酸轉(zhuǎn)化的酶活性較高，并且油酸的積累來(lái)自棕櫚酸;授粉后第15～25 d花生烯酸含量增加，亞油酸與棕桐酸含量下降，說(shuō)明油酸轉(zhuǎn)化花生烯酸的fae1活躍，同時(shí)花生烯酸的底物可能來(lái)自棕櫚酸;授粉后第 40～50 d芥酸含量增加，伴隨花生烯酸、亞麻酸、亞油酸和油酸含量下降，推測(cè)可能此時(shí)芥酸的來(lái)源是油酸。

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