王志偉 張自陽 林麗婷 張金文 劉明久 喬 巖

(1河南科技學院/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng) 453003；2甘肅農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，甘肅蘭州 730070；3河南師大附中雙語國際學校，河南新鄉(xiāng) 453003)

芥酸(erucic acid，C22 ∶1Δ13)屬超長鏈脂肪酸，是以光合產(chǎn)物蔗糖為主要碳源，通過碳鏈的延長和去飽和作用形成的[1]。芥酸是制備聚乙烯膜、山崳醇、山崳酸、尼龍、感光材料、乳化劑、香精、潤滑油等的原材料，在機械、化工、冶金、油漆、紡織、橡膠、醫(yī)藥等行業(yè)被廣泛應用，是一種重要的工業(yè)原料[2-3]。目前，工業(yè)芥酸主要來源于高芥酸甘藍型油菜，因此提高油菜中芥酸的含量具有重要意義。同時，油菜也是植物油的重要來源，其菜籽油食用量占國內(nèi)食用植物油的57.2%[4]，且菜籽油中的芥酸含量對于人類的健康具有重要影響。研究表明，菜籽油中的芥酸可能影響菜籽油在人體內(nèi)的消化，引起心肌損傷，使腎上腺組織的膽固醇水平上升，且容易使脂肪在心臟組織中積累，如果長期食用芥酸含量高的菜籽油，會增加食用者患心血管類疾病的幾率，因此我國對用于食用油的菜籽中芥酸含量的要求是低于1%，而工業(yè)上對芥酸含量的要求是60%，甚至更高[5-6]。通過雜交選育等傳統(tǒng)育種方法，我國先后育出了多個芥酸含量低于1%的食用油菜品種，而育出的高芥酸品種含油量僅40%左右，芥酸含量約為50%，但傳統(tǒng)育種方法局限性較大，芥酸含油量很難再提高[7-8]。因此，利用生物技術的手段提高芥酸含量已成為油菜高芥酸育種的重要方向[9-10]。

油酸(oleic acid，C18∶1)作為超長鏈脂肪酸和多不飽和脂肪酸合成的底物，其代謝途徑有2條，一是在原來碳鏈的基礎上在脂肪酸延長酶1(fatty acid elongation 1，F(xiàn)AE1)作用下繼續(xù)延長，繼而合成C20∶1、C22∶1等超長鏈脂肪酸；二是在脂肪酸去飽和酶(fatty acid desaturase2，F(xiàn)AD2)作用下繼續(xù)去飽和，從而合成C18∶2、C18∶3等多不飽和脂肪酸。因此提高芥酸的含量一方面可通過提高fae1基因的表達量，以合成更多的芥酸，另一方面可沉默fad2基因的表達，減少油酸的去飽和作用，為芥酸的合成提供更多的底物[11]。

人工miRNA(artificial miRNA，amiRNA)是以生物體內(nèi)的miRNA為模板，設計一段miRNA及miRNA?序列替換原來前體序列中的miRNA∶miRNA?，從而使新生成的前體序列經(jīng)過剪切作用能夠有目的地對特定靶基因進行沉默。相比傳統(tǒng)沉默基因方式，amiRNA具有高特異性、高效性、高遺傳穩(wěn)定性、高生物安全性等特點，已被廣泛運用于植物的代謝功能、基因功能等相關研究[12-13]。

芥酸的調(diào)節(jié)研究多是利用傳統(tǒng)的反義抑制、RNAi等手段沉默基因的表達[14]，而amiRNA在甘藍型油菜芥酸調(diào)控中的研究尚未見報道。本研究利用amiRNA技術，針對甘藍型油菜fad2的基因序列設計特異的amiRNA，并利用特異性啟動子Napin，研究amiRNA對油菜芥酸合成相關基因和芥酸含量的調(diào)控，以期為amiRNA在甘藍型油菜中的應用和培育理想芥酸含量的油菜品種奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

遺傳轉(zhuǎn)化油菜品種是由甘肅農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院油菜育種實驗室提供的高芥酸甘藍型油菜品種MY15(油酸14.38%、亞油酸11.69%、芥酸47.26%)和低芥酸甘藍型油菜品種 LEA01(油酸 67.36%、亞油酸18.04%、芥酸0.72%)。本試驗所用菌株均由甘肅農(nóng)業(yè)大學植物基因組學實驗室保存，大腸桿菌(E.coli)DH5α、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404、pCEPSPS[由pCAMBIA1300載體改造而來，載體內(nèi)的潮霉素(Hyg)抗性被草甘膦(EPSPs)抗性替代]、pCENN(在pCEPSPS的多克隆位點利用EcoRⅠ和KpnⅠ酶切和T4連接酶添加Napin啟動子，然后用SalⅠ和HindⅢ酶切連接Nos終止子得到)，pRS300 amiRNA克隆載體。

DNA聚合酶(AP111-01)、克隆載體(CT101-01)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(GF201-01)、氨芐青霉素(GG101-01)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(GF101-01)、卡那霉素(Kanamycin，Kna，GG201-01)、T4 連接酶(FL101-01)、XbaⅠ(JX101-01)、EcoRI(JE201-01)、KpnⅠ(JE201-01)、HindⅢ(JH101-01)、普通瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒(TIANGEN，DP209)，均購自北京自全式金公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 人工miRNA片段的克隆 將Bnfad2(AY577313)的序列提交至amiRNA設計網(wǎng)站W(wǎng)MD3，利用pRS300為模板設計針對BnFAD2的專用amiRNA引物(表1)，利用設計出的引物進行重疊PCR克隆amiRNAD2，各輪反應的引物、模板以及產(chǎn)生的片段大小詳見表2，最終獲得的f片段即為目標片段。

表1 FAD2的amiRNA引物Table1 The amiRNA primmers of FAD2

表2 重疊PCR各輪反應產(chǎn)物及其引物與模板Table2 The production of overlapping PCR and the primmer and template

1.2.2 表達載體pCENND的構建 將重疊PCR獲得的目標片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后，連接到PMD-19T載體，利用片段內(nèi)含的KpnⅠ和XbaⅠ的酶切位點進行酶切驗證并回收，然后將回收目標片段利用T4連接酶連接到pCENN載體，組成表達載體pCENND2，表達載體經(jīng)EcoRⅠ/KpnⅠ和XbaⅠ/HindⅢ酶切驗證無誤后，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌進行轉(zhuǎn)化。油菜的轉(zhuǎn)化參照Kopertekh等[15]和鄒智[16]的方法，并略作改進。

1.2.3 轉(zhuǎn)化陽性株鑒定及種子脂肪酸含量分析 切取無菌培養(yǎng)的油菜幼苗上胚軸和下胚軸作為浸染的外植體，預培養(yǎng)2 d后進行農(nóng)桿菌的浸染，經(jīng)過愈傷誘導、發(fā)芽、植株發(fā)育和生根，從而發(fā)育成完整植物。在此過程中，在培養(yǎng)基中添加草甘膦，對愈傷組織的幼芽、幼芽發(fā)育植株及植株生根過程進行陽性植株的初步篩選。轉(zhuǎn)化株經(jīng)過草甘膦篩選后，取幼苗葉片提取轉(zhuǎn)化苗葉片DNA作為模板，利用抗除草劑基因EPSPs設計特異性引物(表3)，并進行定量PCR，然后進行陽性株的鑒定。

表3 轉(zhuǎn)化陽性植株檢測PCR引物Table3 The detect PCR primer for transgenic positive strain

將經(jīng)過鑒定的陽性株移栽至花盆，開花后45 d，待種子接近成熟時取新鮮的油菜種子，提取種子總RNA，同時利用近紅外光譜法[17]測定種子油酸、亞油酸、芥酸的含量。BnFAD2基因的定量分析，以BnEF1基因作為內(nèi)參基因，以未轉(zhuǎn)化的品種中fad2基因的表達為參照，進行相對定量分析。定量分析所用的引物詳見表4。

表4 甘藍型油菜轉(zhuǎn)化植株定量引物Table4 The quantification primmer for transgenic Brassica napus

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS17.0軟件對未轉(zhuǎn)化植株和轉(zhuǎn)化植株相關數(shù)據(jù)進行多重比較分析，檢測差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 amiRNA片段的克隆

利用WMD3設計BnFAD2基因amiRNA的特異性引物，以pRS300為模板，經(jīng)過3輪的重疊PCR，每輪利用瓊脂糖凝膠電泳回收，最后可以克隆出amiRNAD2片段，即PCR中的片段f。由圖1可知，片段a略大于250 bp，片段b介于150～200 bp之間，片段c接近300 bp，片段d和e為相同大小的片段，接近于500 bp，而片段f接近750 bp。以上結果與每個片段的理論長度基本相符，即片段a理論長度為272 bp，片段b理論長度為171 bp，片段c理論長度為298 bp，片段d理論長度為481 bp，片段e理論長度為481 bp，片段f理論長度為701 bp，說明克隆的片段是有效的。

2.2 表達載體的酶切驗證

經(jīng)KpnⅠ和XbaⅠ雙酶切之后，2泳道產(chǎn)生1條略小于500 bp的片段，4泳道為EcoRⅠ和HindⅢ酶切后的電泳圖，酶切后產(chǎn)生2條片段，1條約1 100 bp，另1條約750 bp，較大的條帶為酶切后的Napin啟動子，較小的片段為amiRNAD2＋NOS片段(圖2-A)。因為在amiRNAD2的 5′端和NOS的 3′端各存在一個HindⅢ的酶切位點(圖2-B)，所以在酶切時amiRNAE1＋NOS片段作為一個整體片段被切下，因此其實際大小應該為2個片段之和，即732 bp。

圖2 pCENND雙酶切驗證Fig.2 The verify of pCENND by double digest

2.3 陽性植株的鑒定

以經(jīng)過草甘膦篩選的陽性植株葉片DNA為模板，以EPSPs基因的特異性引物進行PCR擴增，由圖3可知，陽性植株可擴增1條大小約200 bp的條帶，而未經(jīng)轉(zhuǎn)化的植株則沒有任何條帶，說明表達載體成功轉(zhuǎn)入陽性植株。

圖3 轉(zhuǎn)化油菜陽性株檢測Fig.3 The detection of positive tranformed rapeseed

2.4 轉(zhuǎn)化植株fad2基因表達和脂肪酸組成分析

pCENND2經(jīng)過農(nóng)桿菌浸染，分別轉(zhuǎn)入了2個受體材料MY15和LEA01中，并獲得了陽性株，共移栽8株轉(zhuǎn)化株，成活6株，MY15和LEA01分別各成活3株，提取轉(zhuǎn)化株的T0種子和未轉(zhuǎn)化種子的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后對FAD2基因的表達進行相對定量。結果表明，低芥酸品種LEA01轉(zhuǎn)化株FAD2基因的表達量極顯著低于未轉(zhuǎn)化的植株，且轉(zhuǎn)化株T0-2的fad2基因的表達量顯著低于轉(zhuǎn)化株T0-1和T0-3；高芥酸品種MY15的轉(zhuǎn)化株種子fad2表達量相對于未轉(zhuǎn)化的植株顯著降低，且轉(zhuǎn)化株T0-2的fad2基因的表達量顯著低于轉(zhuǎn)化株T0-1和T0-3(圖4)。

圖4 甘藍型油菜轉(zhuǎn)化植株種子fad2基因表達Fig.4 The fad2 gene expression in transgenic Brassica napus seeds

由表5可知，高芥酸品種 MY15和低芥酸品種LEA01轉(zhuǎn)化株種子油酸含量均明顯增加，其中MY15轉(zhuǎn)化株油酸含量極顯著高于CK，而LEA01轉(zhuǎn)化株顯著高于CK。與CK相比，高芥酸品種MY15和低芥酸品種LEA01轉(zhuǎn)化株種子亞油酸含量均極顯著降低，最大降幅約為17%。轉(zhuǎn)化株芥酸含量均明顯高于CK，高芥酸品種MY15轉(zhuǎn)化株芥酸含量均極顯著高于CK，最高可增加5.12%，最少也增加了3.11%；而低芥酸LEA01轉(zhuǎn)化株芥酸增加的幅度較低，最高只增加了0.45%，最低僅增加了0.16%，且所有材料的芥酸含量均低于1%，僅轉(zhuǎn)化株T0-1和T0-3顯著高于CK。

表5 甘藍型油菜轉(zhuǎn)化植株種子脂肪酸含量分析Table5 Analysis of fatty acids content of transgenic Brassica napus seed /%

3 討論

目前調(diào)控芥酸的合成主要通過以下3個途徑:一是使芥酸合成的關鍵酶基因BnFAE1過表達，增加芥酸含量，或者沉默該基因表達，降低芥酸含量，如Katavic等[18]利用擬南芥的FAE1基因轉(zhuǎn)化油菜，芥酸含量提高了8%～10%；淮東欣[19]通過在甘藍型油菜中超表達BnFAE1基因，得到了芥酸含量高達63%的轉(zhuǎn)化植株。二是在油菜中引入外源LPAAT基因，并且將該基因與BnFAE1結合，從而增加芥酸合成量及其與甘油sn-2位的結合以提高種子中的芥酸含量，如陳柳等[20]利用LPAAT和KCS基因共轉(zhuǎn)化甘藍型油菜，低芥酸油菜品種的芥酸含量提高到10.5%，高芥酸油菜品種芥酸含量提高了5%，達到62.8%；Kanras等[21]利用Ld-LPAAT＋Bn-fae1轉(zhuǎn)化甘藍型油菜，得到了芥酸含量高達72%的轉(zhuǎn)化植株，其后代的芥酸含量也穩(wěn)定在54%左右。三是調(diào)控亞油酸合成的關鍵酶基因Bnfad2，沉默該基因可以為芥酸合成提供更多的底物，或者過表達該基因，調(diào)控脂肪酸的組成，本研究通過amiRNA沉默fad2基因的表達，使芥酸含量顯著提高；Jadhav等[22]通過利用基因沉默技術RNAi的方式沉默fad2基因，成功地將甘藍型油菜轉(zhuǎn)化植株芥酸含量提高了5%～19%；Mietkiewska等[23]利用Hairpin-RNA技術沉默fad2基因，所獲得的甘藍型油菜轉(zhuǎn)化植株后代種子中芥酸含量提高了16%；Loo[24]通過誘變的方式使fad2基因的表達受到抑制，也成功地提高了轉(zhuǎn)化株種子芥酸含量。但是通過利用這種方式提高芥酸的含量有很大的限制性，其原因在于沉默fad2基因雖然能夠為芥酸合成提供更多的底物，但FAE1基因的表達沒有顯著提高，造成芥酸的合成能力受到限制，因此高芥酸品種芥酸含量的提高明顯高于低芥酸品種，其原因就是因為不同芥酸含量的油菜品種FAE1基因的表達不同。芥酸的調(diào)控是一個復雜的過程，需要各個方面的配合，按照作物生產(chǎn)上的“源·庫·流”理論，油酸只是芥酸合成的“源”，要想芥酸含量達到預期目標，還需要“流”能夠暢通，即合成芥酸的能力需提高，而甘油結合芥酸的能力為芥酸的“庫”，既提高甘油結合芥酸的量，才能有效提高芥酸的含量[25]。研究表明，通過調(diào)節(jié)fad2基因的表達只能單方面提高芥酸含量，要想使芥酸含量達到80%以上的理想水平，還需要結合FAE1和LPAAT基因的過表達，共同組成多元表達載體[26]。

植物基因調(diào)控轉(zhuǎn)化與外源基因的拷貝數(shù)目、基因整合的染色體位置、遺傳穩(wěn)定性等因素密切相關[6]，但本研究利用amiRNA技術避免了以上幾個因素的影響，amiRNA與傳統(tǒng)的基因沉默方法相比，具有特異性高、沉默效果好、遺傳穩(wěn)定性較高等優(yōu)點[6]。其原因在于，首先在amiRNA載體構建的過程中，整個premiRNA序列改變的只有大約21 nt的 miRNA和miRNA?序列，其余的序列則相當于植物的內(nèi)源序列，且在植物體內(nèi)不編碼蛋白，從而降低了轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性問題，其結構與植物內(nèi)源的miRNA具有高度的相似性，該特性決定了amiRNA具有良好的遺傳穩(wěn)定性[27-29]。

與前人研究相比，本研究具有獨特的優(yōu)越性，同時由于miRNA和miRNA?的設計只針對Bnfad2基因，既保證了沉默效果，又降低了脫靶的可能性。amiRNAD2沉默fad2基因的沉默效果及轉(zhuǎn)化植株種子內(nèi)脂肪酸含量的變化都說明了amiRNA技術能夠有效沉默fad2基因的表達，從而減少油酸的繼續(xù)去飽和生成多不飽和脂肪酸，從而使種子內(nèi)積累更多的油酸，這也為油菜種子內(nèi)脂肪酸成分的調(diào)節(jié)提供了一條有效的途徑。在今后的研究中可以繼續(xù)利用amiRNA技術對基因的沉默效果有針對性地改變種子脂肪酸合成過程中特定基因的表達，從而有效改變種子內(nèi)脂肪酸的組成，改變其營養(yǎng)結構，提高營養(yǎng)價值，進一步提高油菜種子的附加值。

amiRNAD2對轉(zhuǎn)化品種種子內(nèi)fad2基因的沉默效果顯著，但在不同芥酸含量的甘藍型油菜品種轉(zhuǎn)化株內(nèi)，fad2基因的表達雖然都下降，但是不同芥酸含量的油菜品種內(nèi)fad2基因下降的幅度是不同的。高芥酸品種降低的相對較小，而低芥酸品種的降低反而較大，這是因為高芥酸品種內(nèi)fad2基因的表達量低于低芥酸品種，所以基因沉默的時候其相對變化反而小。同時，不同轉(zhuǎn)化株內(nèi)fad2基因的表達量是不同的，其表達差異甚至達到了顯著水平，這種差異可能是因為在轉(zhuǎn)化過程中，外源基因序列在轉(zhuǎn)入受體材料過程中，插入基因位置的不同而造成。

4 結論

本研究結果表明，amiRNA技術能夠很好地沉默fad2基因，使得fad2基因的表達量在高芥酸甘藍型油菜品種中只有未轉(zhuǎn)化之前表達量的6.67%～10.00%，其芥酸含量增加了2.11%～5.12%，在低芥酸甘藍型油菜品種中fad2基因的表達量降低了30%～50%，芥酸含量增加了0.16%～0.45%；同時不論高芥酸品種還是低芥酸品種，脂肪酸的組成都發(fā)生了很大的變化，油酸增加 4.99%～10.17%，亞油酸降低 10.71%～16.88%，很好地調(diào)節(jié)了油菜種子內(nèi)脂肪酸的組成。綜上所述，利用amiRNA技術可有效調(diào)控甘藍型油菜脂肪酸的組成，提高轉(zhuǎn)化株種子芥酸和油酸的含量，降低亞油酸的含量，改善菜籽油的品質(zhì)，提高菜籽的經(jīng)濟價值。