富勒烯單大環(huán)多胺衍生物對輻射引起小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用研究

陳琪萍 何佳恒 王關(guān)全 羅順忠 馬宗平 劉國平

（中國工程物理研究院核物理與化學(xué)研究所 綿陽 621900）

核能與核技術(shù)的發(fā)展使得放射性物質(zhì)被廣泛用于各行各業(yè)，與此同時，發(fā)生核輻射事故的幾率也逐漸增大。急性放射損傷多在放射醫(yī)學(xué)防護(hù)實踐中，對體內(nèi)受照者的醫(yī)學(xué)處理措施有兩類：一是應(yīng)用相應(yīng)的藥物，以減少放射性核素在進(jìn)入部位的吸收或加速體內(nèi)沉積核素的排出；二是用局部清洗、灌洗或手術(shù)的方法，除去沉積于某部位的核素。但核輻射事故一旦發(fā)生，其實際情況往往涉及的地域大、人員多、傷情復(fù)雜，后者不能滿足實際要求。因此，防治防護(hù)的根本措施主要是通過減少吸收和加速放射性核素在體內(nèi)的排除，即尋找合適的核素阻吸劑或促排劑。研究表明富勒烯具有優(yōu)良的自由基清除功能，如果將富勒烯與具有核素促排功效的基團(tuán)聯(lián)結(jié)，可望獲得性能更優(yōu)的放射性重核素促排化合物，在實現(xiàn)促排的同時兼清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，即實現(xiàn)促排和抗自由基作用的雙重功能[1?3]?；诖?，我們將富勒烯作為特殊基團(tuán)引入到具有強螯合功能的大環(huán)多胺化合物中，希望在提高作為促排劑的大環(huán)多胺化合物的促排性能同時對受損傷肌體進(jìn)行一定程度的修復(fù)。在前期研究中發(fā)現(xiàn)富勒烯大環(huán)多胺衍生物對鈾有一定的促排作用[4]，本研究將衍生物通過尾靜脈注射的方式注入受照動物體內(nèi)，考察衍生物對射線致?lián)p傷的修復(fù)效果。

由于水的含量約占生物體的80%，輻射使水分子電離成H+和OH?自由基，當(dāng)環(huán)境物理因素或外源性化學(xué)物質(zhì)直接或間接誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基得不到及時清除，或自由基的產(chǎn)生和清除失去平衡時，常會造成自由基對機體的損傷。線粒體是對損傷極為敏感的細(xì)胞器，不僅參與細(xì)胞的能量代謝，也是自由基產(chǎn)生的主要場所，線粒體受到自由基攻擊后其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能均可能發(fā)生病理改變。生物體在遭受損傷時，往往發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用，過氧化作用的產(chǎn)物比較復(fù)雜，其產(chǎn)物之一的丙二醛(Malondialdehyde, MDA)可以抑制蛋白質(zhì)的合成，研究中常以MDA含量來反映脂質(zhì)過氧化的水平和對細(xì)胞膜的傷害程度，因而尋找有效的抗自由基的保護(hù)劑，對于防治放射損傷具有重要意義。

國內(nèi)外學(xué)者對富勒烯的制備、純化、結(jié)構(gòu)測定、理化性質(zhì)等方面都進(jìn)行了大量的研究工作[5?8]，在清除自由基方面亦有報道[4,9]，但對氧自由基損傷的直接保護(hù)作用未見報道，我們采用小鼠肝線粒體自由基損傷模型研究富勒烯衍生物的細(xì)胞保護(hù)作用，可以為研究射線照射早期機體功能損害的臨床防治提供新的實驗依據(jù)。

1 設(shè)備與材料

Beckman J2-21M 冷凍離心機，貝克曼儀器公司；RS2000 X射線生物輻照系統(tǒng)，劑量率1.7cGy·s?1；Flash varioskan 酶標(biāo)儀，美國 Thermo公司；SN3400N掃描電子顯微鏡，日立公司。

昆明種小白鼠，18?20 g，8周齡，第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。

富勒烯單大環(huán)多胺衍生物(CA)(2.75 mg·mL?1)本實驗室制備，純度≥95%；MDA試劑盒，南京建成生物技術(shù)公司；Folin-酚蛋白定量試劑盒，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；線粒體分離液：0.25mol·L?1蔗糖-1 mmol·L?1二乙基三胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)混合溶液（42.7875g蔗糖，0.3722g Na2EDTA，溶于500 mL水，調(diào)pH=7.6）。

2 實驗方法

2.1 富勒烯單大環(huán)多胺衍生物的合成及表征

CA結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 CA的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of CA.

合成路線及表征參考文獻(xiàn)[4]。

經(jīng)1H NMR和13C NMR檢測CA的純度≥95%。

2.2 分組與輻照

實驗組分為正常對照組、輻射損傷組和促排劑保護(hù)組，促排擠保護(hù)組又分為事前保護(hù)組和事后干預(yù)組，每組五只小鼠，除正常對照組外，每組分別接受12 Gy、20 Gy、40 Gy和80 Gy的X射線輻照。另外取小鼠五只，提取線粒體后將所得的線粒體合并作為離體鼠肝線粒體，分為正常對照組、輻射損傷組、事前保護(hù)組和事后干預(yù)組，除正常對照組外，每組分別接受20 Gy和40 Gy的X射線輻照。

2.3 小鼠肝線粒體的提取

解剖小鼠，取出肝臟，盡量剔去筋膜，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffered solution, PBS)緩沖溶液(pH=7.4)洗去血液，吸干血水；用小剪刀于冰浴的小燒杯中將肝剪成小塊，用分離液將剪好的組織塊轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的玻璃勻漿器中，上下均勻勻漿；勻漿液1 000 r·min?14 oC 離心10 min；取上清液，12 000 r·min?14 oC 離心10 min；棄上清液，加約5 mL分離液用光滑玻璃棒輕輕懸浮起上層沉淀，吸取移至離心管內(nèi)，加入分離液12000r·min?14 oC 離心10min，重復(fù)兩次，黃褐色沉淀物即為鼠肝線粒體。線粒體蛋白含量用 Folin-酚蛋白定量試劑盒(Lowry法)測定，并測定線粒體腫脹度和線粒體 MDA含量[10]。

2.4 線粒體蛋白含量測定

線粒體蛋白含量測定采用市售的 Folin-酚試劑盒。其測試原理是：在酸性條件下，考馬斯亮蘭G-250染料與蛋白質(zhì)疏水區(qū)結(jié)合，顏色由棕色變?yōu)樗{(lán)色，該藍(lán)色化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度的高低成正比關(guān)系。將稀釋的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum, BSA)與檢測試劑混合，測量在650 nm處的吸收值，在建立由一系列稀釋的BSA建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線的情況下，蛋白質(zhì)的濃度可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線而確定。

2.5 線粒體MDA含量測定

取肝線粒體勻漿20 μL，按照MDA測定試劑盒說明書的步驟加樣，漩渦混合器混勻，95 oC水浴40 min，流水冷卻，532 nm測吸光度，蒸餾水調(diào)零，測各樣品吸光度值。

式中，CMDA為待測樣品MDA含量；Ad為測定管吸光度值；Ac為對照管吸光度值；As為標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值；Ab為空白管吸光度值；Cs為標(biāo)準(zhǔn)品濃度；Cp為待測樣品蛋白濃度。

2.6 線粒體腫脹度測定

線粒體腫脹程度與線粒體的生理和病理性反應(yīng)有關(guān)，過度的腫脹則是線粒體結(jié)構(gòu)損傷的表現(xiàn)。本實驗將活體小鼠分為事前保護(hù)組和事后干預(yù)組，事前保護(hù)組小鼠在預(yù)先注入一定劑量的CA后1 h接受80 Gy的X射線輻照，24 h后提取肝線粒體；事后干預(yù)組小鼠預(yù)先接受80 Gy的X射線輻照，照后立即注入一定劑量的CA，24 h后提取肝線粒體。新鮮的線粒體經(jīng)輻照后，若發(fā)生線粒體腫脹，將表現(xiàn)為懸液混濁度下降，在520 nm處的光密度降低。線粒體按 500 μg·mL?1線粒體蛋白的量重懸于測定液中，37 oC恒溫水浴振蕩60 min，分別于0 min、15 min、30 min、60 min取線粒體懸液用酶標(biāo)儀測定520 nm處的吸光度，吸光度的變化直接反映線粒體損傷程度。

用于測定線粒體腫脹度的線粒體蛋白置于冰浴，放置加測定的時間不超過48 h，以保持線粒體膜的完整性。

3 結(jié)果與討論

3.1 MDA含量

鼠肝線粒體在輻照作用下，脂質(zhì)過氧化物水平增加。本實驗觀察促排藥物CA對鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化物生成的作用。結(jié)果表明，線粒體經(jīng)X射線輻照損傷后，其MDA含量顯著增加。表1為活體小鼠事前保護(hù)組和事后干預(yù)組的MDA測量結(jié)果，從表1看出，小鼠不管是在預(yù)先注射CA或是照射后注射CA的情況下都能明顯抑制線粒體MDA生成，事前保護(hù)組的平均抑制率為46%，事后干預(yù)組平均抑制率為60%，與照射組比較有統(tǒng)計學(xué)顯著性意義，但尚不能降低至正常對照組水平。表2為小鼠離體線粒體事前保護(hù)組和事后干預(yù)組的MDA測量結(jié)果，從表2可以看出，鼠肝線粒體在X射線輻照作用下，脂質(zhì)過氧化物水平增加，而促排劑 CA有較強的抑制線粒體脂質(zhì)過氧化物生成的能力。

表1 CA對活體鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化物的影響( ±s, n=5) ±sTable 1 Effect of CA on the lipid peroxidation products of rat liver mitochondria in vivo (, n=5).

表1 CA對活體鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化物的影響( ±s, n=5) ±sTable 1 Effect of CA on the lipid peroxidation products of rat liver mitochondria in vivo (, n=5).

組別Group蛋白含量Protein content / μg·mL?1 MDA含量MDA content / μmol·g?1平均抑制率Inhibit rate / %事前保護(hù)組Protect beforehand CA-12 Gy 960.50±56.52 15.96±0.94 28.59 CA-20 Gy 800.50±89.36 17.49±1.95 45.05 CA-40 Gy 920.50±34.08 15.21±0.56 56.60 CA-80 Gy 888.80±80.49 18.75±1.70 53.50事后干預(yù)組Treatment afterward CA-12 Gy 883.83±47.01 10.56±0.56 52.75 CA-20 Gy 830.50±49.52 8.03±0.47 74.77 CA-40 Gy 820.50±70.40 13.00±1.12 63.39 CA-80 Gy 815.50±65.84 20.44±1.65 49.31正常組 Normal group 812.17±108.21 7.39±0.98 ―對照組Contrast group 12 Gy 1 073.83±84.79 22.35±1.76 ―20 Gy 1 047.17±136.88 31.83±4.16 ―40 Gy 938.83±77.18 35.51±2.92 ―80 Gy 1 190.50±148.58 40.32±5.03 ―

表2 CA對離體鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化物的影響(± s, n=5)Table 2 Effect of CA on the lipid peroxidation products of rat liver mitochondria in vitro (± s, n=5).

表2 CA對離體鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化物的影響(± s, n=5)Table 2 Effect of CA on the lipid peroxidation products of rat liver mitochondria in vitro (± s, n=5).

組別Group蛋白含量Protein content / μg·mL?1 MDA含量MDA content / μmol·g?1平均抑制率Inhibit rate / %事前保護(hù)組Protect beforehand CA-20 Gy 728.83±56.08 19.21±1.48 39.65 CA-40 Gy 813.83±128.08 18.84±2.97 46.94事后干預(yù)組Treatment afterward CA-20 Gy 1 010.50±136.63 17.81±2.41 44.05 CA-40 Gy 1 003.83±125.04 15.94±1.99 55.11對照組Contrast group 20 Gy 1 047.17±92.10 31.83±2.80 ―40 Gy 938.83±70.83 35.51±2.68 ―正常組Normal group 812.17±30.05 7.39±0.27 ―

3.2 促排藥物對鼠肝線粒體腫脹度的影響

線粒體輻射損傷后可出現(xiàn)腫脹，表現(xiàn)為線粒體懸液在 520 nm處的吸光度降低，實驗結(jié)果見圖2和表3（每組五只小鼠）。經(jīng)X射線照射的小鼠肝線粒體在60 min時吸光度降低值明顯減少，提示線粒體已經(jīng)處于腫脹狀態(tài)。小鼠靜脈注射CA后，肝線粒體受X射線誘發(fā)產(chǎn)生腫脹的程度明顯低于輻射損傷組肝臟線粒體，不管是事前保護(hù)組還是事后干預(yù)組均對小鼠肝細(xì)胞線粒體腫脹度有明顯抑制作用，數(shù)據(jù)見表3。對照組線粒體腫脹程度明顯增加，事前保護(hù)組小鼠對線粒體腫脹的平均抑制率為35.4%，事后干預(yù)組小鼠對線粒體腫脹的平均抑制率為61.4%，可見線粒體腫脹均受抑制。

圖2 CA對活體小鼠肝線粒體腫脹度的影響Fig.2 Effects of CA on rat liver mitochondria swelling.

表3 CA對線粒體腫脹度的影響(±s, n=5)Table 3 Effects of CA on mitochondria swelling (±s, n=5).

表3 CA對線粒體腫脹度的影響(±s, n=5)Table 3 Effects of CA on mitochondria swelling (±s, n=5).

組別Group線粒體腫脹度Mitochondria swelling平均抑制率Inhibit rate正常組Normal group 0.075±0.009 ―損傷對照組Contrast group 0.497±0.023 ―事前保護(hù)組Protect beforehand 0.321±0.015 35.4%事后干預(yù)組Treatment afterward 0.192±0.011 61.4%

3.3 促排藥物對X射線誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷組織結(jié)構(gòu)的影響

肝切片采用電鏡觀察，2.5%戊二醛固定，環(huán)氧樹脂包埋，常規(guī)電鏡切片，觀察線粒體形貌。輻照前線粒體大部分細(xì)胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，染色質(zhì)分布正常，核膜清晰，核周隙無擴張，細(xì)胞質(zhì)豐富；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體結(jié)構(gòu)正常；線粒體嵴較清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見水腫，見圖3(a)。輻射損傷組小鼠經(jīng)40 Gy輻照后24 h取肝組織樣本電鏡觀察：細(xì)胞局部可見明顯水腫，紅細(xì)胞進(jìn)入竇周隙，匯管區(qū)靜脈及肝內(nèi)血竇輕度擴張，肝細(xì)胞水腫壞死較明顯；48 h后可見細(xì)胞間隙明顯增寬，線粒體變大變圓，部分轉(zhuǎn)化為小空泡狀結(jié)構(gòu)，線粒體呈現(xiàn)水腫狀態(tài)；第4天個別細(xì)胞可見明顯破損，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)水腫，囊腔擴張，肝血竇及竇周隙破損，淤血明顯，見圖3(b)?(d)。圖3(e)?(h)分別為提前注射和照后注射CA后的小鼠肝細(xì)胞切片，電鏡可見：細(xì)胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，染色質(zhì)分布正常，核膜清晰，核周隙無擴張，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常，線粒體嵴清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未見水腫，細(xì)胞間隙結(jié)構(gòu)清晰，膽小管清晰無擴張、微絨毛清晰。與急性輻射損傷組相比具有明顯的細(xì)胞修復(fù)效果。

4 結(jié)語

實驗對富勒烯單大環(huán)多胺衍生物保護(hù)下的小鼠肝線粒體MDA含量、線粒體腫脹度及其形貌進(jìn)行了測定和觀察，結(jié)果表明，X射線輻照可誘發(fā)小鼠機體線粒體受到損傷，從線粒體腫脹度測定和肝組織學(xué)切片均顯示線粒體發(fā)生水腫。MDA含量測定顯示射線照射后的細(xì)胞生成脂質(zhì)過氧化物——丙二醛等物質(zhì)含量升高，小鼠在體和離體肝損傷實驗結(jié)果表明CA能有效抑制射線引起的MDA升高，與照射組比較有統(tǒng)計學(xué)顯著性意義，事前或事后注射CA對MDA的生成的抑制率均可達(dá)到50%以上，但尚不能降低至正常對照組水平，提示可能對線粒體膜有保護(hù)作用；線粒體腫脹度測定結(jié)果顯示事前保護(hù)組小鼠對線粒體腫脹的平均抑制率為 35.4%，事后干預(yù)組小鼠對線粒體腫脹的平均抑制率為61.4%，可見線粒體腫脹均受到抑制；肝臟組織學(xué)切片電鏡照片可見，X射線照射引起的肝組織急性輻射損傷隨時間的延長，壞死程度加重，而注射CA對肝細(xì)胞具有一定的保護(hù)和修復(fù)作用，與輻射損傷對照組相比，較好地維護(hù)了線粒體結(jié)構(gòu)的完整性，其機制可能與富勒烯基類促排劑具有清除過量自由基、維持體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的平衡有關(guān)。

圖3 小鼠肝臟組織學(xué)切片F(xiàn)ig.3 Histological slice of rat liver.

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