金線蓮不同外植體組織培養(yǎng)成苗技術(shù)探討

祁永瓊+王麗莉+羅瑞芳+李開云

摘要：以金線蓮的頂芽、中部莖段和基部莖段為外植體，研究金線蓮組織培養(yǎng)快繁成苗技術(shù)。結(jié)果表明，初代培養(yǎng)階段在MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，以頂芽為外植體，誘導(dǎo)率、增殖倍數(shù)最高；芽苗增殖階段，在MS+6-BA 1.5～2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，3種外植體的芽苗增殖倍數(shù)都較高，其中頂芽增殖倍數(shù)達(dá)到7.5倍；細(xì)弱芽苗在MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+10%馬鈴薯+2%蛋白胨培養(yǎng)基中可長(zhǎng)勢(shì)健壯；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.5 mg/ L+2%活性炭+10%香蕉泥。

關(guān)鍵詞：金線蓮；外植體；組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S682.310.4+3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2014）08-0057-03

金線蓮，又名金線蘭、金絲草、樹草蓮、金線虎頭蕉、金線入骨消等，為蘭科（Orchidaceae）開唇蘭屬（Anoectochilus）植物，是多年生珍稀中草藥，在我國(guó)云南、四川、廣西、福建、臺(tái)灣等地均有分布，但十分稀少，一般生長(zhǎng)于密林下或溪邊潮濕的草叢中。金線蓮富含氨基酸和多種微量元素，有較高的藥用價(jià)值，素有“藥王”“金草”“神藥”“烏人參”等美稱，《全國(guó)中草藥匯編》謂其可治療肺結(jié)核、糖尿病、腎炎、膀胱炎、風(fēng)濕性及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥；在治療肝病、排毒去火、降壓涼血等方面有獨(dú)特效果。民間常用其清水煎服或燉湯，治療小兒驚風(fēng)、婦女白帶以及毒蛇咬傷等。隨著金線蓮的藥用價(jià)值日益被人們所認(rèn)同，在云南的西雙版納、保山、文山、德宏等地，農(nóng)民無節(jié)制、掠奪式采收野生金線蓮的現(xiàn)象比較普遍^[1]，且金線蓮生長(zhǎng)遲緩、開花結(jié)果不易，導(dǎo)致資源匱乏。因此，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖成為培育金線蓮種苗的重要途徑^[2-6]。本試驗(yàn)利用金線蓮進(jìn)行組織培養(yǎng)，以期探索適宜的外植體和高效的成苗技術(shù)，培育健壯試管苗。

1 材料與方法

1.1 材料

材料于2010年4月采自云南保山林區(qū)，引種于云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院園藝實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練基地。

1.2 方法

1.2.1 不同外植體進(jìn)行初代培養(yǎng)

取生長(zhǎng)正常、葉色濃綠、株高5～6 cm的植株莖段，除去根葉，流水沖洗1 h，洗潔精溶液浸泡約10 min，用軟毛刷刷洗莖段節(jié)處絨毛，用自來水清洗干凈。轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)上，用75%乙醇滅菌30～60 s，轉(zhuǎn)入0.1%氯化汞中滅菌8～10 min，邊浸泡邊攪拌以徹底滅菌，然后用無菌水沖洗5次。用解剖刀切取，分為頂芽、帶1個(gè)節(jié)中部莖段和帶1個(gè)節(jié)的基部莖段作為接種的外植體。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為M1、M2、M3、M4，分別添加6-BA為0、1.0、2.0、3.0 mg/L，NAA濃度為0.5 mg/L，培養(yǎng)條件為：光照度1 500～3 000 lx，光照時(shí)間8～10 h/d，溫度（25±2） ℃，MS為基本培養(yǎng)基，pH值為5.8，蔗糖濃度為30 g/L。每處理4瓶，每瓶5個(gè)外植體。培養(yǎng)10 d 后統(tǒng)計(jì)污染率，培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率、增殖倍數(shù)。

1.2.2 不同激素組合對(duì)芽苗增殖途徑的影響

用解剖刀切取無菌苗莖段，分為頂芽、帶1個(gè)節(jié)中部莖段和帶1個(gè)節(jié)的基部莖段，接種于增殖培養(yǎng)基I1、I2、I3、I4。增殖培養(yǎng)基I1～I(xiàn)4分別為添加6-BA 1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，添加NAA 0.5 mg/L，培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)。培養(yǎng)50 d后，調(diào)查成苗情況，統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)、黃化苗率。

1.2.3 壯苗培養(yǎng)

切取增殖培養(yǎng)中產(chǎn)生的芽苗，進(jìn)一步進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，接種于壯苗培養(yǎng)基H1（MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+10%馬鈴薯）、H2（MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+10%馬鈴薯+2%蛋白胨）。每處理4瓶。培養(yǎng) 50 d 后，調(diào)查芽苗生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)。

1.2.4 生根培養(yǎng)

切取約2 cm、生長(zhǎng)健壯的莖段，進(jìn)一步進(jìn)行生根培養(yǎng)，采用1/2MS+NAA 0.5 mg/L，添加0～2%活性炭、0～10%香蕉泥為生根培養(yǎng)基，將小苗放在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)，長(zhǎng)成完整植株。30 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜的初代培養(yǎng)外植體

外植體的選擇和適宜的培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵，決定著能否建立高效的繁殖體系。結(jié)果表明，在初代培養(yǎng)過程中，以頂芽為外植體，在添加2.0 mg/L 6-BA、0.5 mg/L NAA的M3培養(yǎng)基中，污染率最低，誘導(dǎo)率、增殖倍數(shù)最高；中部莖段次之；基部莖段污染率高，誘導(dǎo)率較低（表1），因此認(rèn)為頂芽適宜作金線蓮初代誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)的外植體。

2.2 不同激素組合對(duì)芽苗增殖的影響

在芽苗增殖階段，適宜濃度的6-BA和NAA對(duì)頂芽、中部莖段和基部莖段芽苗的增殖有促進(jìn)作用。NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)，6-BA 濃度為1.5～2.0 mg/L，3種外植體芽苗的增殖倍數(shù)都較高，但是隨著6-BA濃度的增大，增殖倍數(shù)

3 討論

金線蓮組織培養(yǎng)快繁可選用種子、莖段、頂芽或葉片為外植體，再生成苗主要有原球莖、不定芽、叢生芽等3條途徑，張鐵等用種子誘導(dǎo)原球莖^[8]，劉芳等用中部莖段誘導(dǎo)叢生芽^[9]，闞世超等用莖尖誘導(dǎo)叢生芽^[5]，吳坤林等用中段莖段誘導(dǎo)不定芽^[10]，楊柏云等用莖段誘導(dǎo)原球莖^[11]。本試驗(yàn)采用頂芽、中部莖段和基部莖段增殖培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)頂芽的誘導(dǎo)率和增殖倍數(shù)高，芽苗健壯；中部莖段誘導(dǎo)易產(chǎn)生不定芽，誘導(dǎo)率和增殖倍數(shù)次之；基部莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽苗較為細(xì)弱。究其原因，一方面不同部位外植體的莖段組織發(fā)育程度不同；另一方面，不同部位外植體的內(nèi)源激素含量和比例也不同，活性生長(zhǎng)素在植株頂部芽中含量較高^[12]。因此，頂芽生長(zhǎng)旺盛，組織培養(yǎng)產(chǎn)生的芽苗健壯，較適宜作為初代培養(yǎng)外植體。

在金線蓮的組織培養(yǎng)過程中，芽苗增殖是十分關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，只有提高增殖系數(shù)，才能達(dá)到快速繁殖的目的。組織培養(yǎng)產(chǎn)生的細(xì)弱芽苗在添加10%馬鈴薯+2%蛋白胨的壯苗培養(yǎng)基上可長(zhǎng)勢(shì)健壯。因此，頂芽增殖的健壯芽苗、中部莖段增殖的芽苗、增壯后的基部莖段芽苗等均可作為增殖材料繼續(xù)用于增殖和生根，提高金線蓮的組織培養(yǎng)繁殖系數(shù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]余東莉，張培松，范 萍，等. 西雙版納金線蓮分布及利用現(xiàn)狀[J]. 林業(yè)調(diào)查規(guī)劃，2006，31（5）：97-99.

[2]郝麗麗，乙 引，申 剛，等. 金線蓮腋芽增殖培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（7）：18-19.

[3]黃 勇. 金線蓮組織培養(yǎng)新體系建立及優(yōu)化[J]. 北方園藝，2010（13）：178-179.

[4]伍成厚，馮毅敏，賀漫媚，等. 金線蓮種子培養(yǎng)的研究[J]. 中國(guó)野生植物資源，2008，27（1）：47-50.

[5]闞世超，張明生，李 花. 金線蓮叢生芽誘導(dǎo)研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（3）：981-982.

[6]宋麗莎，鄧 偉，文治瑞，等. 金線蓮?fù)庵搀w的篩選及不定芽誘導(dǎo)的研究[J]. 種子，2009，28（9）：19-22.

[7]劉 偉，王牛柱. 金線蓮組織培養(yǎng)增殖培養(yǎng)基的篩選[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（4）：1475-1476.

[8]張 鐵，田雪琪，李 彬. 滇越金線蓮快速繁殖技術(shù)研究[J]. 文山師范高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2006，19（3）：110-114.

[9]劉 芳，韋鵬霄，岑秀芬，等. 外植體和基本培養(yǎng)基對(duì)臺(tái)灣金線蓮叢生芽誘導(dǎo)的影響[J]. 北方園藝，2009（4）：103-104.

[10]吳坤林. 金線蓮快繁及工廠化生產(chǎn)中間試驗(yàn)[J]. 中藥材，1997，20（12）：595-597.

[11]楊柏云，高蔭榆，李春華，等. 金線蓮原球莖的誘導(dǎo)與快速繁殖[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（10）：3999-4001.

[12]郝建軍，康宗利. 植物生理學(xué)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：161.

摘要：以金線蓮的頂芽、中部莖段和基部莖段為外植體，研究金線蓮組織培養(yǎng)快繁成苗技術(shù)。結(jié)果表明，初代培養(yǎng)階段在MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，以頂芽為外植體，誘導(dǎo)率、增殖倍數(shù)最高；芽苗增殖階段，在MS+6-BA 1.5～2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，3種外植體的芽苗增殖倍數(shù)都較高，其中頂芽增殖倍數(shù)達(dá)到7.5倍；細(xì)弱芽苗在MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+10%馬鈴薯+2%蛋白胨培養(yǎng)基中可長(zhǎng)勢(shì)健壯；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.5 mg/ L+2%活性炭+10%香蕉泥。

關(guān)鍵詞：金線蓮；外植體；組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S682.310.4+3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2014）08-0057-03

金線蓮，又名金線蘭、金絲草、樹草蓮、金線虎頭蕉、金線入骨消等，為蘭科（Orchidaceae）開唇蘭屬（Anoectochilus）植物，是多年生珍稀中草藥，在我國(guó)云南、四川、廣西、福建、臺(tái)灣等地均有分布，但十分稀少，一般生長(zhǎng)于密林下或溪邊潮濕的草叢中。金線蓮富含氨基酸和多種微量元素，有較高的藥用價(jià)值，素有“藥王”“金草”“神藥”“烏人參”等美稱，《全國(guó)中草藥匯編》謂其可治療肺結(jié)核、糖尿病、腎炎、膀胱炎、風(fēng)濕性及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥；在治療肝病、排毒去火、降壓涼血等方面有獨(dú)特效果。民間常用其清水煎服或燉湯，治療小兒驚風(fēng)、婦女白帶以及毒蛇咬傷等。隨著金線蓮的藥用價(jià)值日益被人們所認(rèn)同，在云南的西雙版納、保山、文山、德宏等地，農(nóng)民無節(jié)制、掠奪式采收野生金線蓮的現(xiàn)象比較普遍^[1]，且金線蓮生長(zhǎng)遲緩、開花結(jié)果不易，導(dǎo)致資源匱乏。因此，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖成為培育金線蓮種苗的重要途徑^[2-6]。本試驗(yàn)利用金線蓮進(jìn)行組織培養(yǎng)，以期探索適宜的外植體和高效的成苗技術(shù)，培育健壯試管苗。

1 材料與方法

1.1 材料

材料于2010年4月采自云南保山林區(qū)，引種于云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院園藝實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練基地。

1.2 方法

1.2.1 不同外植體進(jìn)行初代培養(yǎng)

取生長(zhǎng)正常、葉色濃綠、株高5～6 cm的植株莖段，除去根葉，流水沖洗1 h，洗潔精溶液浸泡約10 min，用軟毛刷刷洗莖段節(jié)處絨毛，用自來水清洗干凈。轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)上，用75%乙醇滅菌30～60 s，轉(zhuǎn)入0.1%氯化汞中滅菌8～10 min，邊浸泡邊攪拌以徹底滅菌，然后用無菌水沖洗5次。用解剖刀切取，分為頂芽、帶1個(gè)節(jié)中部莖段和帶1個(gè)節(jié)的基部莖段作為接種的外植體。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為M1、M2、M3、M4，分別添加6-BA為0、1.0、2.0、3.0 mg/L，NAA濃度為0.5 mg/L，培養(yǎng)條件為：光照度1 500～3 000 lx，光照時(shí)間8～10 h/d，溫度（25±2） ℃，MS為基本培養(yǎng)基，pH值為5.8，蔗糖濃度為30 g/L。每處理4瓶，每瓶5個(gè)外植體。培養(yǎng)10 d 后統(tǒng)計(jì)污染率，培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率、增殖倍數(shù)。

1.2.2 不同激素組合對(duì)芽苗增殖途徑的影響

用解剖刀切取無菌苗莖段，分為頂芽、帶1個(gè)節(jié)中部莖段和帶1個(gè)節(jié)的基部莖段，接種于增殖培養(yǎng)基I1、I2、I3、I4。增殖培養(yǎng)基I1～I(xiàn)4分別為添加6-BA 1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，添加NAA 0.5 mg/L，培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)。培養(yǎng)50 d后，調(diào)查成苗情況，統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)、黃化苗率。

1.2.3 壯苗培養(yǎng)

切取增殖培養(yǎng)中產(chǎn)生的芽苗，進(jìn)一步進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，接種于壯苗培養(yǎng)基H1（MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+10%馬鈴薯）、H2（MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+10%馬鈴薯+2%蛋白胨）。每處理4瓶。培養(yǎng) 50 d 后，調(diào)查芽苗生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)。

1.2.4 生根培養(yǎng)

切取約2 cm、生長(zhǎng)健壯的莖段，進(jìn)一步進(jìn)行生根培養(yǎng)，采用1/2MS+NAA 0.5 mg/L，添加0～2%活性炭、0～10%香蕉泥為生根培養(yǎng)基，將小苗放在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)，長(zhǎng)成完整植株。30 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜的初代培養(yǎng)外植體

外植體的選擇和適宜的培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵，決定著能否建立高效的繁殖體系。結(jié)果表明，在初代培養(yǎng)過程中，以頂芽為外植體，在添加2.0 mg/L 6-BA、0.5 mg/L NAA的M3培養(yǎng)基中，污染率最低，誘導(dǎo)率、增殖倍數(shù)最高；中部莖段次之；基部莖段污染率高，誘導(dǎo)率較低（表1），因此認(rèn)為頂芽適宜作金線蓮初代誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)的外植體。

2.2 不同激素組合對(duì)芽苗增殖的影響

在芽苗增殖階段，適宜濃度的6-BA和NAA對(duì)頂芽、中部莖段和基部莖段芽苗的增殖有促進(jìn)作用。NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)，6-BA 濃度為1.5～2.0 mg/L，3種外植體芽苗的增殖倍數(shù)都較高，但是隨著6-BA濃度的增大，增殖倍數(shù)

3 討論

金線蓮組織培養(yǎng)快繁可選用種子、莖段、頂芽或葉片為外植體，再生成苗主要有原球莖、不定芽、叢生芽等3條途徑，張鐵等用種子誘導(dǎo)原球莖^[8]，劉芳等用中部莖段誘導(dǎo)叢生芽^[9]，闞世超等用莖尖誘導(dǎo)叢生芽^[5]，吳坤林等用中段莖段誘導(dǎo)不定芽^[10]，楊柏云等用莖段誘導(dǎo)原球莖^[11]。本試驗(yàn)采用頂芽、中部莖段和基部莖段增殖培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)頂芽的誘導(dǎo)率和增殖倍數(shù)高，芽苗健壯；中部莖段誘導(dǎo)易產(chǎn)生不定芽，誘導(dǎo)率和增殖倍數(shù)次之；基部莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽苗較為細(xì)弱。究其原因，一方面不同部位外植體的莖段組織發(fā)育程度不同；另一方面，不同部位外植體的內(nèi)源激素含量和比例也不同，活性生長(zhǎng)素在植株頂部芽中含量較高^[12]。因此，頂芽生長(zhǎng)旺盛，組織培養(yǎng)產(chǎn)生的芽苗健壯，較適宜作為初代培養(yǎng)外植體。

在金線蓮的組織培養(yǎng)過程中，芽苗增殖是十分關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，只有提高增殖系數(shù)，才能達(dá)到快速繁殖的目的。組織培養(yǎng)產(chǎn)生的細(xì)弱芽苗在添加10%馬鈴薯+2%蛋白胨的壯苗培養(yǎng)基上可長(zhǎng)勢(shì)健壯。因此，頂芽增殖的健壯芽苗、中部莖段增殖的芽苗、增壯后的基部莖段芽苗等均可作為增殖材料繼續(xù)用于增殖和生根，提高金線蓮的組織培養(yǎng)繁殖系數(shù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]余東莉，張培松，范 萍，等. 西雙版納金線蓮分布及利用現(xiàn)狀[J]. 林業(yè)調(diào)查規(guī)劃，2006，31（5）：97-99.

[2]郝麗麗，乙 引，申 剛，等. 金線蓮腋芽增殖培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（7）：18-19.

[3]黃 勇. 金線蓮組織培養(yǎng)新體系建立及優(yōu)化[J]. 北方園藝，2010（13）：178-179.

[4]伍成厚，馮毅敏，賀漫媚，等. 金線蓮種子培養(yǎng)的研究[J]. 中國(guó)野生植物資源，2008，27（1）：47-50.

[5]闞世超，張明生，李 花. 金線蓮叢生芽誘導(dǎo)研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（3）：981-982.

[6]宋麗莎，鄧 偉，文治瑞，等. 金線蓮?fù)庵搀w的篩選及不定芽誘導(dǎo)的研究[J]. 種子，2009，28（9）：19-22.

[7]劉 偉，王牛柱. 金線蓮組織培養(yǎng)增殖培養(yǎng)基的篩選[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（4）：1475-1476.

[8]張 鐵，田雪琪，李 彬. 滇越金線蓮快速繁殖技術(shù)研究[J]. 文山師范高等專科學(xué)校學(xué)報(bào)，2006，19（3）：110-114.

[9]劉 芳，韋鵬霄，岑秀芬，等. 外植體和基本培養(yǎng)基對(duì)臺(tái)灣金線蓮叢生芽誘導(dǎo)的影響[J]. 北方園藝，2009（4）：103-104.

[10]吳坤林. 金線蓮快繁及工廠化生產(chǎn)中間試驗(yàn)[J]. 中藥材，1997，20（12）：595-597.

[11]楊柏云，高蔭榆，李春華，等. 金線蓮原球莖的誘導(dǎo)與快速繁殖[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（10）：3999-4001.

[12]郝建軍，康宗利. 植物生理學(xué)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：161.

摘要：以金線蓮的頂芽、中部莖段和基部莖段為外植體，研究金線蓮組織培養(yǎng)快繁成苗技術(shù)。結(jié)果表明，初代培養(yǎng)階段在MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，以頂芽為外植體，誘導(dǎo)率、增殖倍數(shù)最高；芽苗增殖階段，在MS+6-BA 1.5～2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，3種外植體的芽苗增殖倍數(shù)都較高，其中頂芽增殖倍數(shù)達(dá)到7.5倍；細(xì)弱芽苗在MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+10%馬鈴薯+2%蛋白胨培養(yǎng)基中可長(zhǎng)勢(shì)健壯；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.5 mg/ L+2%活性炭+10%香蕉泥。

關(guān)鍵詞：金線蓮；外植體；組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S682.310.4+3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2014）08-0057-03

金線蓮，又名金線蘭、金絲草、樹草蓮、金線虎頭蕉、金線入骨消等，為蘭科（Orchidaceae）開唇蘭屬（Anoectochilus）植物，是多年生珍稀中草藥，在我國(guó)云南、四川、廣西、福建、臺(tái)灣等地均有分布，但十分稀少，一般生長(zhǎng)于密林下或溪邊潮濕的草叢中。金線蓮富含氨基酸和多種微量元素，有較高的藥用價(jià)值，素有“藥王”“金草”“神藥”“烏人參”等美稱，《全國(guó)中草藥匯編》謂其可治療肺結(jié)核、糖尿病、腎炎、膀胱炎、風(fēng)濕性及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等癥；在治療肝病、排毒去火、降壓涼血等方面有獨(dú)特效果。民間常用其清水煎服或燉湯，治療小兒驚風(fēng)、婦女白帶以及毒蛇咬傷等。隨著金線蓮的藥用價(jià)值日益被人們所認(rèn)同，在云南的西雙版納、保山、文山、德宏等地，農(nóng)民無節(jié)制、掠奪式采收野生金線蓮的現(xiàn)象比較普遍^[1]，且金線蓮生長(zhǎng)遲緩、開花結(jié)果不易，導(dǎo)致資源匱乏。因此，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖成為培育金線蓮種苗的重要途徑^[2-6]。本試驗(yàn)利用金線蓮進(jìn)行組織培養(yǎng)，以期探索適宜的外植體和高效的成苗技術(shù)，培育健壯試管苗。

1 材料與方法

1.1 材料

材料于2010年4月采自云南保山林區(qū)，引種于云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院園藝實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練基地。

1.2 方法

1.2.1 不同外植體進(jìn)行初代培養(yǎng)

取生長(zhǎng)正常、葉色濃綠、株高5～6 cm的植株莖段，除去根葉，流水沖洗1 h，洗潔精溶液浸泡約10 min，用軟毛刷刷洗莖段節(jié)處絨毛，用自來水清洗干凈。轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)上，用75%乙醇滅菌30～60 s，轉(zhuǎn)入0.1%氯化汞中滅菌8～10 min，邊浸泡邊攪拌以徹底滅菌，然后用無菌水沖洗5次。用解剖刀切取，分為頂芽、帶1個(gè)節(jié)中部莖段和帶1個(gè)節(jié)的基部莖段作為接種的外植體。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為M1、M2、M3、M4，分別添加6-BA為0、1.0、2.0、3.0 mg/L，NAA濃度為0.5 mg/L，培養(yǎng)條件為：光照度1 500～3 000 lx，光照時(shí)間8～10 h/d，溫度（25±2） ℃，MS為基本培養(yǎng)基，pH值為5.8，蔗糖濃度為30 g/L。每處理4瓶，每瓶5個(gè)外植體。培養(yǎng)10 d 后統(tǒng)計(jì)污染率，培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率、增殖倍數(shù)。

1.2.2 不同激素組合對(duì)芽苗增殖途徑的影響

用解剖刀切取無菌苗莖段，分為頂芽、帶1個(gè)節(jié)中部莖段和帶1個(gè)節(jié)的基部莖段，接種于增殖培養(yǎng)基I1、I2、I3、I4。增殖培養(yǎng)基I1～I(xiàn)4分別為添加6-BA 1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，添加NAA 0.5 mg/L，培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)。培養(yǎng)50 d后，調(diào)查成苗情況，統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)、黃化苗率。

1.2.3 壯苗培養(yǎng)

切取增殖培養(yǎng)中產(chǎn)生的芽苗，進(jìn)一步進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，接種于壯苗培養(yǎng)基H1（MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+10%馬鈴薯）、H2（MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+10%馬鈴薯+2%蛋白胨）。每處理4瓶。培養(yǎng) 50 d 后，調(diào)查芽苗生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)。

1.2.4 生根培養(yǎng)

切取約2 cm、生長(zhǎng)健壯的莖段，進(jìn)一步進(jìn)行生根培養(yǎng)，采用1/2MS+NAA 0.5 mg/L，添加0～2%活性炭、0～10%香蕉泥為生根培養(yǎng)基，將小苗放在生根培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)，長(zhǎng)成完整植株。30 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜的初代培養(yǎng)外植體

外植體的選擇和適宜的培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)的關(guān)鍵，決定著能否建立高效的繁殖體系。結(jié)果表明，在初代培養(yǎng)過程中，以頂芽為外植體，在添加2.0 mg/L 6-BA、0.5 mg/L NAA的M3培養(yǎng)基中，污染率最低，誘導(dǎo)率、增殖倍數(shù)最高；中部莖段次之；基部莖段污染率高，誘導(dǎo)率較低（表1），因此認(rèn)為頂芽適宜作金線蓮初代誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)的外植體。

2.2 不同激素組合對(duì)芽苗增殖的影響

在芽苗增殖階段，適宜濃度的6-BA和NAA對(duì)頂芽、中部莖段和基部莖段芽苗的增殖有促進(jìn)作用。NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)，6-BA 濃度為1.5～2.0 mg/L，3種外植體芽苗的增殖倍數(shù)都較高，但是隨著6-BA濃度的增大，增殖倍數(shù)

3 討論

金線蓮組織培養(yǎng)快繁可選用種子、莖段、頂芽或葉片為外植體，再生成苗主要有原球莖、不定芽、叢生芽等3條途徑，張鐵等用種子誘導(dǎo)原球莖^[8]，劉芳等用中部莖段誘導(dǎo)叢生芽^[9]，闞世超等用莖尖誘導(dǎo)叢生芽^[5]，吳坤林等用中段莖段誘導(dǎo)不定芽^[10]，楊柏云等用莖段誘導(dǎo)原球莖^[11]。本試驗(yàn)采用頂芽、中部莖段和基部莖段增殖培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)頂芽的誘導(dǎo)率和增殖倍數(shù)高，芽苗健壯；中部莖段誘導(dǎo)易產(chǎn)生不定芽，誘導(dǎo)率和增殖倍數(shù)次之；基部莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽苗較為細(xì)弱。究其原因，一方面不同部位外植體的莖段組織發(fā)育程度不同；另一方面，不同部位外植體的內(nèi)源激素含量和比例也不同，活性生長(zhǎng)素在植株頂部芽中含量較高^[12]。因此，頂芽生長(zhǎng)旺盛，組織培養(yǎng)產(chǎn)生的芽苗健壯，較適宜作為初代培養(yǎng)外植體。

在金線蓮的組織培養(yǎng)過程中，芽苗增殖是十分關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，只有提高增殖系數(shù)，才能達(dá)到快速繁殖的目的。組織培養(yǎng)產(chǎn)生的細(xì)弱芽苗在添加10%馬鈴薯+2%蛋白胨的壯苗培養(yǎng)基上可長(zhǎng)勢(shì)健壯。因此，頂芽增殖的健壯芽苗、中部莖段增殖的芽苗、增壯后的基部莖段芽苗等均可作為增殖材料繼續(xù)用于增殖和生根，提高金線蓮的組織培養(yǎng)繁殖系數(shù)。

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