彭浩+陳文強+鄧百萬+解修超

摘要：系統(tǒng)闡述了藥用植物虎杖（Polygonum cuspidatum）內(nèi)生菌的多樣性、抑菌活性、次生代謝產(chǎn)物及生物轉化等，并提出了亟待解決的問題，包括研究過于集中、研究方法較為單一、代謝產(chǎn)物尚待明確等。

關鍵詞：虎杖；內(nèi)生菌；多樣性；次生代謝產(chǎn)物

中圖分類號：Q939.9 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0001-03

虎杖（Polygonum cuspidatum）是蓼科蓼屬的多年生草本植物，作為傳統(tǒng)中藥，具有活血定痛、清熱利濕、止咳化痰等作用，其主要成分白藜蘆醇及白藜蘆醇苷具有保護心肌細胞、改善微循環(huán)、抑制血小板聚集、抵抗內(nèi)毒素休克、降血脂、抗脂質過氧化、鎮(zhèn)咳、平喘等多種功效，成為近年來人們關注的熱點^[1-7]。植物內(nèi)生菌（plant endophyte）是指在其部分或全部生活史中存活于健康植物組織內(nèi)部、不引發(fā)宿主植物表現(xiàn)出明顯感染癥狀的微生物。利用組織培養(yǎng)法可從植物的根、莖、葉、果實中分離純化出一定數(shù)量的植物內(nèi)生菌。植物內(nèi)生菌是巨大的生物資源庫，其次生代謝產(chǎn)物非常豐富且具有多種活性，如調(diào)節(jié)植物生長、殺蟲、抑菌、抗腫瘤等^[8-11]。本研究對虎杖內(nèi)生菌的多樣性、抑菌活性、活性代謝產(chǎn)物、次生代謝產(chǎn)物等方面進行探討，以期為保護及合理開發(fā)利用虎杖內(nèi)生菌資源提供參考。

1 虎杖內(nèi)生菌多樣性

植物內(nèi)生菌分布廣泛，種類繁多，目前研究人員至少已在23屬453種禾本科植物中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生真菌^[12]。對新鮮虎杖組織進行嚴格表面消毒后，利用組織培養(yǎng)法、組織勻漿涂布法等方法可分離出相應的內(nèi)生菌。目前，已從藥用植物虎杖中分離出內(nèi)生真菌、內(nèi)生細菌及內(nèi)生放線菌。

1.1 虎杖內(nèi)生真菌的多樣性

用75%乙醇、0.1%HgCl2溶液對新鮮干凈的虎杖根莖表面進行消毒，取韌皮部以下材料，采用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)分離內(nèi)生真菌。曾松榮等對采自廣東省乳源縣山區(qū)的新鮮虎杖根莖進行內(nèi)生真菌分離，獲得內(nèi)生真菌24株，經(jīng)初步鑒定，其中無孢菌群（Mycelia sterlia）13株，青霉屬（Penicillium sp.）6株，曲霉屬（Aspergillus sp.）1株，叢梗孢屬（Monilia sp.）1株，枝孢屬（Cladosporium sp.）1株，膠帚霉屬（Gliocladium sp.）1株，毛霉屬（Mucor sp.）1株，表明該植株內(nèi)生真菌的優(yōu)勢種為無孢菌群、青霉屬^[13]。馬云桐等從四川省達州市宜漢縣、宜賓市、廣元市旺蒼縣等10個地區(qū)的虎杖根、根莖中共分離獲得內(nèi)生真菌164株，經(jīng)顯微形態(tài)觀察鑒定為青霉屬、曲霉屬、擬青霉屬（Paecilomyces sp.）、地霉屬（Geotrichum sp.）、桶孢屬（Amblyosporium sp.）、芽孢菌屬（Blastomyces sp.）、明枝霉屬（Hyalodendron sp.）、鐮孢霉屬（Fusarium sp.）、盤多毛孢屬（Pestalotia sp.）、絲核菌屬（Rhizoctonia sp.）等10屬真菌，其中曲霉屬104株，青霉屬29株^[14]。劉蕓等從采自西安市植物園等地的虎杖中分離出15株內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定分別屬于頂孢霉（Acremonium sp.）、曲霉屬、刺盤孢屬（Colletotrichum sp.）、鐮孢霉屬真菌^[15]。葉仁元等對采自四川省青城山及雙流地區(qū)野生虎杖根莖進行內(nèi)生真菌分離，得到24株內(nèi)生真菌，經(jīng)形態(tài)觀察及ITS序列鑒定后，其分別為青霉屬、曲霉屬、小克銀漢霉屬（Cunninghamella sp.）、木霉屬、鐮孢屬、枝孢霉屬、擬青霉屬，其中青霉屬為優(yōu)勢種群，占41.6%^[16]。彭浩從采自陜西省漢中市勉縣、留壩縣等地的11株虎杖根莖中分離出內(nèi)生真菌116株，初步鑒定為曲霉屬、青霉屬、鐮孢霉屬、毛霉屬、擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis sp.）、枝孢霉屬（Cladosporium sp.）、鏈隔孢屬（Alternaria sp.）、木霉屬（Trichoderma sp.）及無孢菌類等真菌，其中曲霉屬、青霉屬、無孢菌群是該地區(qū)虎杖內(nèi)生真菌的優(yōu)勢種群^[17]。目前，研究人員已從不同采集地的虎杖中分離純化出內(nèi)生真菌300余株，經(jīng)初步鑒定，其分屬青霉屬、曲霉屬、鐮孢屬、枝孢屬、無孢菌群等24屬真菌，青霉屬、曲霉屬、無孢菌群是虎杖內(nèi)生真菌的優(yōu)勢種群。馬云桐等研究發(fā)現(xiàn)，采集地、生境以及虎杖的年齡均對內(nèi)生菌的分離具有一定的影響，其中多年生野生虎杖的內(nèi)生真菌種類比幼年人工種植虎杖多^[14]。

1.2 虎杖內(nèi)生細菌和放線菌的多樣性

采用組織勻漿法、涂布法及平板劃線法，對經(jīng)嚴格表面消毒的虎杖內(nèi)生細菌及放線菌進行分離^[18]。研究人員對秦巴山區(qū)野生虎杖中的內(nèi)生放線菌進行分離，分離出47株內(nèi)生放線菌，經(jīng)初步鑒定，47株菌分屬鏈霉菌屬（Streptomyces sp.）、小單孢菌屬（Micromonospora sp.）、鏈孢囊菌屬（Streptosporangium sp.）^[19-20]。Sun等對采自四川省成都市、雙流縣、青城山等地的虎杖進行內(nèi)生細菌分離，獲得244株內(nèi)生細菌，對其進行16S rDNA序列分析，結果表明，這些內(nèi)生細菌分屬放線菌目（Actinomycetales）、芽孢桿菌目（Bacillales）、根瘤菌目（Rhizobiales）、假單孢菌目（Pseudomonadales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）^[21]。

2 虎杖內(nèi)生菌的抑菌活性

虎杖作為傳統(tǒng)中藥，具有抗菌、抗病毒、鎮(zhèn)咳、平喘等作用^[22]。盧成瑛等對虎杖的提取液進行抑菌研究，結果發(fā)現(xiàn)，中藥虎杖在體外具有明顯的抑菌作用，對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草桿菌（Bacillus subtilis）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、大腸桿菌（Escherichia coli）、傷寒桿菌（Salmonella typhi）、甲型鏈球菌（Alpha-haemolytic steptococci）等有顯著的抗菌作用^[23-25]。研究人員對分離到的24株內(nèi)生真菌進行研究發(fā)現(xiàn)，有3株內(nèi)生真菌分別對枯草芽孢桿菌、藤黃八疊球菌（Micrococcus luteus）、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、乙型副傷寒桿菌（Salmonella paratyphi B）、白色念珠菌（Monilia albican）、擲孢酵母（Sporobolomycetaceae sp.）等8種受試菌均有明顯的抑制作用，其中曲霉屬內(nèi)生真菌HJ4對以上8種受試菌均表現(xiàn)出明顯的抑制作用。放線菌是抗生素的主要生產(chǎn)菌。在已知的人畜用抗生素中，有 2/3 以上的抗生素是由放線菌產(chǎn)生的^[26-28]。研究人員從虎杖中分離得到的47株內(nèi)生放線菌進行抑菌研究發(fā)現(xiàn)，17株菌株對大腸桿菌、沙門氏菌（Salmonella typhl）、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢菌、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、白色念珠菌具有不同程度的抗菌活性，占所有分離菌株的36.2%，其中6 株具有較明顯的抑菌活性，菌株PEA023對所有靶標菌均有較強的抑制作用，菌株PEA023、PEA032對銅綠假單胞菌具有拮抗活性。有學者對分離獲得的41株內(nèi)生放線菌進行抑菌試驗時發(fā)現(xiàn)，有13株菌至少對1種靶標菌表現(xiàn)出不同的抑菌活性，占總檢測菌株的31.7%，特別是菌株PEA004、PEA013發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢菌、大腸桿菌、沙門氏菌等4種靶標菌表現(xiàn)出不同程度的抑菌活性，顯示了廣譜的抗菌活性，可能具有很好的生物防治潛力。此外，內(nèi)生細菌也具有抑制致病真菌、致病細菌的作用。有學者發(fā)現(xiàn)，虎杖內(nèi)生細菌對致病真菌、致病細菌具有抑制作用，在分離的244株內(nèi)生細菌中有13株內(nèi)生細菌能抑制藤倉赤霉菌（Gibberella fujikuroi），18株抑制黑曲霉（Aspergillus niger），6株抑制煙曲霉（Aspergillus fumigatus），4株抑制克雷白氏肺炎菌（Klebsiella pneumoniae），12株抑制金黃色葡萄球菌，6株抑制枯草桿菌，暫未發(fā)現(xiàn)能抑制大腸桿菌的菌株。肖青等對分自虎杖的內(nèi)生真菌CB50進行抑菌活性研究，結果發(fā)現(xiàn)，該菌株能有效抑制克雷白氏肺炎菌、枯草桿菌^[29]。由于藥用植物虎杖自身具有較明顯的抑菌作用，在內(nèi)生菌與其長期協(xié)同進化過程中，基因的互相交換使得部分內(nèi)生菌具有與虎杖類似的抑菌作用。同時，由于微生物自身易發(fā)生突變，可能會產(chǎn)生一些具有新的抗菌活性的物質。

3 虎杖內(nèi)生菌代謝產(chǎn)活性物質

虎杖主要含有蒽醌類、黃酮類化合物、酚性以及其他化學成分。目前，蒽醌類、芪類化合物等，特別是白藜蘆醇及白藜蘆醇苷是研究熱點，對虎杖內(nèi)生真菌的活性代謝產(chǎn)物研究也主要集中在白藜蘆醇及白藜蘆醇苷上。曹庸等在對虎杖的組織培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)1株產(chǎn)白藜蘆醇的真[JP2]菌B-39，其原始產(chǎn)量為47.0 μg/L，利用正交試驗對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，該菌株的白藜蘆醇產(chǎn)量提高了1倍左右，達到86.7 μg/L，該菌最佳培養(yǎng)條件為：葡萄糖20.0 g，硝酸銨2.0 g/L，溫度28 ℃，pH值自然，振蕩速度100 r/min^[30-31]。研究人員對從虎杖中分離純化的15株內(nèi)生真菌進行產(chǎn)白藜蘆醇篩選，結果發(fā)現(xiàn)5株菌產(chǎn)白藜蘆醇，其中以菌株H8產(chǎn)量最高，達1.528 mg/L。[JP]彭浩等發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)白藜蘆醇苷及白藜蘆醇的內(nèi)生真菌11株，利用HPLC高效液相色譜法對其進行含量檢測，其中菌株M-56發(fā)酵液及菌絲中白藜蘆醇苷含量達1.029 mg/L，在菌株 L-18 的發(fā)酵液及菌絲的萃取液中既能檢測到白藜蘆醇又能檢測到白藜蘆醇苷，該菌株同時具有代謝產(chǎn)2種活性物質的能力，且產(chǎn)量均在4 mg/L左右^[32-33]。內(nèi)生菌與宿主植物在長期協(xié)同進化過程中，構成了穩(wěn)定的生態(tài)關系。由于植物與內(nèi)生菌相互間發(fā)生了基因交換，使內(nèi)生菌具有產(chǎn)生與植物相同或相似化合物的能力。因此，內(nèi)生菌是天然活性物質的重要來源。虎杖中有很多具有不同生理作用的化學物質，可能還存在大量類似白藜蘆醇、白藜蘆醇苷的結構類似物。

4 虎杖內(nèi)生菌的生物轉化

白藜蘆醇作為一種具有降血脂、抗脂質過氧化、鎮(zhèn)咳、平喘、抗癌等多種藥理作用的活性物質，一直受到學者們的重視。目前，白藜蘆醇主要從虎杖中提取獲得，白藜蘆醇在虎杖中含量較低且提取率極低，所以提高白藜蘆醇產(chǎn)量成為研究熱點。虎杖中的白藜蘆醇苷含量較白藜蘆醇高，白藜蘆醇苷可在微生物作用下轉化為白藜蘆醇，這給研究人員提供了一條提高白藜蘆醇產(chǎn)量的新途徑^[34-37]。有學者對虎杖內(nèi)生真菌B-39與虎杖懸浮細胞之間的共培養(yǎng)關系及其白藜蘆醇的積累特征進行了初步研究，結果發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)生真菌B-39與虎杖懸浮細胞共培養(yǎng)過程中，兩者均能正常生長且相互促進。游松等用絲狀真菌總狀共頭霉31264（Syncephastrum racemosum 31264）轉化從虎杖藥材中提取得到白藜蘆醇苷，結果發(fā)現(xiàn)，該菌株能夠高效地將白藜蘆醇苷轉化為白藜蘆醇^[38]。劉華金等用分離自虎杖根、莖的6株內(nèi)生真菌對虎杖進行直接發(fā)酵，將白藜蘆醇苷轉化為白藜蘆醇，結果表明，6株內(nèi)生真菌均具有轉化白藜蘆醇苷為白藜蘆醇的能力，其中分離于莖內(nèi)的J1轉化率最高，達 25.6%^[39]。肖蘇堯等在對微生物轉化虎杖中白藜蘆醇苷的研究中發(fā)現(xiàn)了1株內(nèi)生真菌，可將白藜蘆醇苷轉化為白藜蘆醇，經(jīng)初步鑒定，該菌株為卡門培爾青霉（Penicillium camemberti）屬真菌^[40]。研究人員對從虎杖中分離出24株真菌，得到CB41、CB48 2株具有轉化活性的真菌，從虎杖莖部分離提純的內(nèi)生真菌具有多樣性。利用轉化率高的虎杖內(nèi)生菌對虎杖中的白藜蘆醇苷進行轉化，可提高虎杖中白藜蘆醇的產(chǎn)率。

5 存在的問題

5.1 研究過于集中

目前，關于虎杖內(nèi)生菌的研究報道主要集中在內(nèi)生真菌方面，而對其內(nèi)生細菌、內(nèi)生放線菌的研究甚少?？讈喣械炔捎猛坎挤◤幕⒄冉M織中分離出47株內(nèi)生放線菌，發(fā)現(xiàn)其中有17株菌具有一定抑菌作用^[20]。有學者從虎杖中分離出240株內(nèi)生細菌，并對其進行抑菌研究。

5.2 研究方法較單一

一般采取組織培養(yǎng)法分離虎杖內(nèi)生菌，由于沒有相適應的培養(yǎng)條件，可能有很多虎杖內(nèi)生菌沒有被分離出來，應當采用方法對其進行分離。張晶晶等采用免培養(yǎng)法直接提取紅豆杉總DNA，利用細菌16S rDNA引物進行特異性擴增，結合適宜的載體克隆到宿主細胞中構建細菌克隆文庫，文庫中檢測到20個屬，其中蛭弧菌屬（Bdellovibrio）、梭菌屬（Clostridium）、Winogradskyella等是采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法未曾得到的^[41]。目前很少有對菌株的培養(yǎng)條件以及菌株自身進行深入研究的報道，應當對產(chǎn)活性物質菌株的穩(wěn)定性、菌株的培養(yǎng)條件以及菌株的誘變改造等進行深入研究。

5.3 代謝產(chǎn)物尚待明確

目前，對于虎杖內(nèi)生菌活性次生代謝產(chǎn)物的研究主要集中在白藜蘆醇及白藜蘆醇苷上。有研究發(fā)現(xiàn)，大部分虎杖內(nèi)生菌具有廣泛抑制細菌、真菌乃至腫瘤細胞的作用，目前尚未深入研究內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物中起到抑制作用的大量活性物質。

6 展望

自1866年Bary首先提出了植物內(nèi)生菌一詞后，植物內(nèi)生菌開始進入研究人員的視野。目前，研究人員已先后從幾百種禾本科植物中發(fā)現(xiàn)了上百種內(nèi)生菌，植物內(nèi)生菌及其次生代謝產(chǎn)物成為人們獲取新穎天然抗癌藥物的潛在對象^[42-43]。天然藥物虎杖作為一種傳統(tǒng)中藥在我國已有幾千年的歷史，受其生長周期及白藜蘆醇提取率所限，市場上的白藜蘆醇價格昂貴且供給不足。隨著研究人員對虎杖及其內(nèi)生真菌研究的深入，利用虎杖內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)生白藜蘆醇將成為解決白藜蘆醇資源緊缺的有效途徑。

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