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      地膚子提取物毒殺螨的蛋白組雙向電泳分析

      2014-10-26 11:09:28張利軍王海香李生才李玲曹揮
      關(guān)鍵詞:等電點酯酶山楂

      張利軍,王海香,李生才,李玲,曹揮

      (1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,山西 太谷030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,山西 太谷030801)

      山楂葉螨(Tetr anychus viennensis Zacher)屬蛛形綱(Arachnida)螨目(Acarifor mes)葉螨科(Tetranychidae),是我國北方果區(qū)核桃、蘋果、梨、櫻桃、山楂樹的主要害螨,常造成葉片枯焦早落,削弱樹勢,影響產(chǎn)量[1]。目前,對該螨的控制主要依賴化學(xué)農(nóng)藥,已經(jīng)產(chǎn)生了嚴(yán)重抗性[2]。

      植物源殺蟲劑對環(huán)境污染小、害蟲較難產(chǎn)生抗藥性,對有益生物較安全,還有降低害螨迅速產(chǎn)生農(nóng)藥抗性的潛能[3]。已有研究表明,瑞香狼毒、河蒴蕘花、牽牛子、旋覆花、砂地柏、百部、苦艾等的活性成分對成、若螨有較好的防效,有的具有殺卵活性甚至熏殺毒力,部分混用還有增效作用[4~10]。地膚子(Kochia scoparia)是藜科1年生草本植物,俗名掃帚苗、掃帚菜。地膚子提取物有很好的殺螨活性[11],地膚子提取物處理后,螨體內(nèi)解毒酶和消化酶的含量均有所變化[12]。但地膚子活性成分作用的靶標(biāo)蛋白區(qū)域究竟在哪里,目前尚沒有相關(guān)研究。

      蛋白質(zhì)是生命功能的執(zhí)行體,蛋白質(zhì)組學(xué)在蛋白水平上定量、動態(tài)、整體地研究生物體,闡明生物體全部蛋白的表達模式及功能模式[13]。通過比較正常體與病變體,給藥前后蛋白圖譜的變化,藥物蛋白組學(xué)可提供藥物作用和藥物反應(yīng)的分子機制信息[14]。目前蛋白組研究主要是利用雙向聚丙烯酰 胺 電 泳 (Two-di mensional electr ophoresis,2-DE)來分離復(fù)雜的蛋白組分。近年來,2-DE被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和微生物學(xué)等研究領(lǐng)域[15,16]。在昆蟲學(xué)研究方面,2-DE應(yīng)用于碟蛹金小蜂卵黃蛋白、家蠶雄性附腺及其Ng突變體蛋白質(zhì)、抗性家蠅蛹期蛋白和岡比亞按蚊唾液蛋白[17~20]。在藥物蛋白組學(xué)中,2-DE也為定量和定性評價具有不同表型或基因型的組織細胞之間、正常與病理狀態(tài)、給藥與不給藥時蛋白質(zhì)表達差異提供了可能[21]。多項研究結(jié)果顯示,毒性效應(yīng)可以通過蛋白的方式顯示出來[22,23]。

      蛋白組學(xué)研究有害螨報道較少,本文通過2-DE技術(shù)分析給藥與不給藥時山楂葉螨蛋白質(zhì)表達差異,研究藥物靶標(biāo)識別和確認、藥物的行為機理,為開發(fā)利用殺蟲植物地膚子防治山楂葉螨奠定理論基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 供試材料

      山楂葉螨來自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗果園核桃樹上飼養(yǎng)的敏感品系,地膚子氯仿提取物由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實驗室提供。

      1.2 方法

      將供試山楂葉螨分對照組和處理組放在不同的培養(yǎng)皿內(nèi),分別用清水和1 mg·mL-1地膚子提取物噴灑在山楂葉螨體表,5 s后吸凈體表液體,24 h后用液氮快速冷凍并轉(zhuǎn)移到離心管中,稱其重備用。

      參照Tal等[24]的方法提取總蛋白,用Bradfor d法測定蛋白質(zhì)濃度,等電聚焦采用膠內(nèi)加樣法,第一向等電聚焦電泳p H 3~10,線性固化IPG干膠條長度17 c m,蛋白加樣量為200μg。SDSPAGE分離膠濃度為12.5%,濃縮膠濃度為5%,電泳后凝膠染色銀染色,銀染色采用Yan etal.的方法[25]。圖像掃描后用 PDQuest 2-DE 8.0.1軟件進行分析。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 對照和處理蛋白質(zhì)組圖譜

      供試山楂葉螨從培養(yǎng)到雙向電泳各重復(fù)3次,供試藥劑處理山楂葉螨和對照的蛋白雙向電泳銀染圖譜如圖1所示,其Patter n非常相似。對照膠得出蛋白點1139±102個,處理膠得出點1183±106個。這些蛋白點等電點和分子量分布范圍廣,但多數(shù)集中于等電點5.0~9.0之間,分子量20~70 ku的區(qū)域。從對照凝膠中選取一個圖譜做蛋白點匹配實驗,使處理凝膠中蛋白點與對照膠中的對應(yīng)起來,與對照膠中同一蛋白點相匹配的點為同一種蛋白質(zhì),匹配結(jié)果顯示兩塊膠相匹配的蛋白點為500±45個,對照膠和處理膠平均匹配率分別為43.8%和42.3%。對照的匹配率稍高于處理膠,這與把它選做參考膠有關(guān)。

      2.2 對照和處理蛋白組的表達變化

      以對照膠作為參照,通過PD-QUEST軟件搜索和數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析,發(fā)現(xiàn)有262±23個蛋白點在表達量上有顯著變化(P<0.05),其中142±13個點是2倍上調(diào)的點,另外120±11個點是下調(diào)的點,介于兩者之間的點有237±21個。與對照相比處理蛋白組差異表達譜見圖2。同時322±29個點只在處理膠中,其中蛋白點參數(shù)(等電點和分子量)見表1,蛋白點主要集中區(qū)如圖2中框1所示。表1顯示蛋白分子量主要集中在30~70 ku,等電點集中在pI(5~6)和pI(7.5~9.0)之間。發(fā)生變化的蛋白是中等分子的蛋白,在pI(5~6)區(qū)處理膠明顯增加了一些蛋白。

      圖1 供試藥劑對山楂葉螨蛋白影響雙向凝膠電泳圖譜Fig.1 Comparison of 2-DE maps of T.viennensis Zacher treated by agents

      圖2 對照和處理疊加的蛋白比較Fig.2 Comparison of 2-DE maps on super position of two gels

      表1 藥劑處理凝膠中增加蛋白質(zhì)點的參數(shù)Table 1 The parameter of increased protein spots on the treated gel

      3 討論與結(jié)論

      蛋白質(zhì)組學(xué)在藥物研究中主要應(yīng)用于受體或標(biāo)志物的鑒定、受體的評價及毒理學(xué)、蛋白質(zhì)相互作用及其功能的研究、藥物代謝產(chǎn)物的研究等方面[26]。有人運用蛋白質(zhì)組學(xué)2-DE技術(shù)研究過殺蟲劑對有害昆蟲的毒理,如Shar ma等研究了p H3.5~7.0和p H6.0~10.0氨基甲酸酯類殺蟲劑對褐飛虱的毒性機理[27],他指出被氨基甲酸酯類農(nóng)藥處理后所有的細胞骨架蛋白被引起上調(diào),而這些蛋白是神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的重要靶標(biāo)之一。本試驗采用地膚子提取物觸殺山楂葉螨,引起其蛋白顯著性變化(P<0.05),顯著性變化的蛋白有可能是地膚子提取物的靶標(biāo)蛋白。

      曹揮等[28]研究表明,地膚子提取物處理后,山楂葉螨體內(nèi)蛋白含量、蛋白酶活性有所升高,谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶和羧酸酯酶被激活,SOD活性顯著增高;乙酰膽堿酯酶、Ca2+-ATP酶活力受到一定程度的抑制。并推斷地膚子活性成分可能通過抑制山楂葉螨體內(nèi)的酯酶同工酶活性來降低其消化代謝,通過降低單胺氧化酶的活性來降低其解毒代謝,通過抑制乙酰膽堿酯酶活性阻斷其神經(jīng)傳遞,再加上自由基毒害引起螨過度興奮,最終導(dǎo)致螨體的死亡。而本試驗中研究發(fā)現(xiàn)地膚子提取物觸殺螨可引起中等分子量酸性蛋白質(zhì)增加。SWISS-2DPAG數(shù)據(jù)庫顯示乙酰膽堿酯酶的前體的等電點在pI(5.17~5.26)之間[29],處理膠酸性蛋白的增加恰是在pI(5~6),可能存在乙酰膽堿酯酶受到抑制,其前體不能正常轉(zhuǎn)化,停留在前體狀態(tài)積聚起來,同時引發(fā)了與其相關(guān)的一系列蛋白的錯誤表達。同時,谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的分子量為55 ku,等電點pI(4.5~4.8)作為昆蟲解毒代謝作用和動物組織損傷的敏感指標(biāo),其升高也可能造成組織內(nèi)蛋白的表達混亂。如果這種假設(shè)正確,恰好和酶活性測定的結(jié)果相吻合,但是這種假設(shè)需要進一步研究驗證。

      蛋白質(zhì)是基因表達的產(chǎn)物,它的形成要經(jīng)過基因組的轉(zhuǎn)錄后加工、翻譯調(diào)控以及翻譯后加工修飾等許多步驟,每個蛋白可產(chǎn)生多種蛋白異構(gòu)體,極大豐富了蛋白質(zhì)的數(shù)量,增加了復(fù)雜性。但是,試驗結(jié)果說明運用蛋白技術(shù)在分子水平研究殺蟲劑的毒性是可能的,部分蛋白的研究將有助于目標(biāo)基因的鑒定和功能的預(yù)測。因此需要進一步采用其他方法或手段深入地研究鑒定這些蛋白,并了解它們的功能。

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