邢詠梅，李向東，郭順星

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軟腐病病原菌對金釵石斛致病性的形態(tài)學(xué)研究

邢詠梅，李向東，郭順星

100193 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所（邢詠梅、郭順星）；100195 北京，中國藥材公司（李向東）

旨在研究軟腐病病原菌終極腐霉對金釵石斛致病的形態(tài)學(xué)特征。

利用終極腐霉孢子懸液噴灑法對金釵石斛組培苗葉片進(jìn)行致病性實(shí)驗，對健康的以及感染終極腐霉 48 h 后的金釵石斛的葉片應(yīng)用水壓片法在光學(xué)顯微鏡下觀察兩者的形態(tài)差別。對健康的金釵石斛及感染終極腐霉 48 h 后的植株的根、莖、葉進(jìn)行掃描電鏡觀察并分別比較致病前后微觀結(jié)構(gòu)的差異。

壓片法觀察葉片部位結(jié)果顯示，健康的金釵石斛葉片結(jié)構(gòu)完整；致病組可見終極腐霉病原菌在金釵石斛葉片中生長旺盛，大量卵孢子和孢子囊分布于葉肉細(xì)胞間。感染病原菌后的葉肉細(xì)胞完整性受到嚴(yán)重破壞。掃描顯微鏡觀察結(jié)果顯示：葉肉細(xì)胞、葉鞘組織、幼嫩根尖細(xì)胞以及根被為發(fā)病的關(guān)鍵部位。在莖部菌絲通過消解細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞。在根部菌絲除通過消解細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞外，還通過根被表面的許多孔洞進(jìn)入細(xì)胞。病原菌菌絲體通過葉背面大量分布的氣孔結(jié)構(gòu)或葉表面極具破壞性地進(jìn)入葉片體內(nèi)，并形成典型的附著胞結(jié)構(gòu)。

終極腐霉主要通過機(jī)械穿透和分泌降解酶破壞寄主細(xì)胞的細(xì)胞壁及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

石斛； 植物組成部分； 終極腐霉； 軟腐病

石斛屬（spp.）是蘭科植物的第二大屬，目前該屬在全世界共發(fā)現(xiàn) 1100 多種，在我國有 76 個種和 2 個變種。其中，石斛屬藥用植物金釵石斛（Lindl）是傳統(tǒng)名貴中藥，被我國歷版藥典所收錄[1-2]，以其干燥或新鮮的莖入藥，具有滋陰清熱、益胃生津之功效[3]。由于近年來石斛屬藥用植物被過度挖掘，野生資源瀕臨枯竭，石斛屬藥用植物已被國家列為一級保護(hù)植物名錄。

隨著人們對石斛中藥材需求量的逐漸增加，目前藥用石斛屬植物人工栽培的面積不斷擴(kuò)大[4]。然而，隨之而來的各種病害不斷出現(xiàn)，嚴(yán)重阻礙了人工栽培的進(jìn)一步發(fā)展，并給種植戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。有研究表明，鐘器腐霉曾在云南省導(dǎo)致大規(guī)模鼓槌石斛、球花石斛、線葉石斛莖部的腐爛[5]。在以往的研究中，我們鑒定出金釵石斛軟腐病的病原真菌為終極腐霉[6]。

為深入研究軟腐病病原菌終極腐霉的致病機(jī)理，探討其在導(dǎo)致金釵石斛軟腐病病害過程中的機(jī)制，金釵石斛的根、莖和葉等部位發(fā)生的顯微、超微結(jié)構(gòu)變化以及病原菌在植物體內(nèi)的分布和侵染情況，本研究采用水壓片法以及掃描電鏡觀察法分別對接種終極腐霉病原菌前后金釵石斛苗的根、莖和葉的結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行觀察，為深入理解病原菌的侵染過程，揭示其形態(tài)學(xué)特征和侵染機(jī)制，以及為更好預(yù)防和控制此病害的發(fā)生發(fā)展提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 金釵石斛組培苗為本實(shí)驗室保存。

1.1.2 主要儀器 ZEISS Axio Imager A1 型光學(xué)顯微鏡購自德國蔡司公司；JSM-6510 LV 型掃描電子顯微鏡購自日本電子株式會社。

1.2 方法

1.2.1 病原菌終極腐霉對金釵石斛的致病性試驗 將剛出瓶的生長一致的株高 4 ~ 6 cm 的新鮮金釵石斛組培苗預(yù)先栽種在裝有滅菌的栗樹皮基質(zhì)的塑料花盆內(nèi)，每個花盆栽種 3 株組培苗。病原菌為金釵石斛發(fā)病植株上分離得到的終極腐霉。采用孢子噴灑葉片的方法進(jìn)行致病性試驗，接種的病原菌為孢子懸浮液（1 × 106個/ml），均勻地噴灑于金釵石斛幼苗的葉片上[7]。對照組噴灑無菌水。致病組和對照組均設(shè) 30 個重復(fù)。接種后置于 20 ~ 25 ℃溫室塑料膜保濕培養(yǎng) 48 h，然后揭去塑料膜，每天觀察植株發(fā)病情況。

1.2.2 常規(guī)水壓片法進(jìn)行光鏡觀察 取1 滴 10% KOH 溶液滴加到載玻片上，然后取健康的和發(fā)病 48 h 的金釵石斛的葉片作為觀察對象，徒手切片法切取盡量薄的葉片組織，浸入 KOH 溶液中裝片，光學(xué)顯微鏡下觀察、照相。

1.2.3 掃描電鏡樣品的制備流程 取健康的以及發(fā)病 48 h 的金釵石斛的根、莖、葉等部位，用于制作掃描電鏡樣品，樣品的處理按文獻(xiàn)[8]進(jìn)行：2.5% 戊二醛室溫下固定 4 ~ 6 h 后，以 PBS（pH 6.8，0.1 mol/L）洗滌 3 次，每次 30 min；分別經(jīng) 30%、50%、70%、80%、90% 以及 100% 丙酮梯度脫水，每個梯度 3 次，每次 30 min；再經(jīng)純醋酸異戊酯置換 3 次，每次 30 min；經(jīng) CO2臨界點(diǎn)干燥、粘樣，再經(jīng)過金離子噴濺，最后于掃描電子顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 光學(xué)顯微鏡觀察致病前后金釵石斛葉片顯微結(jié)構(gòu)的變化

在光學(xué)顯微鏡下，正常的葉肉細(xì)胞細(xì)胞壁較厚，排列規(guī)則，葉綠體分布于細(xì)胞的周邊（圖1A），而發(fā)病的葉肉細(xì)胞壁變薄，細(xì)胞完整性受到破壞，葉綠體分散、零亂（圖 1B，C）。終極腐霉病原菌在金釵石斛葉片內(nèi)大量存在，菌絲生長旺盛，直徑可達(dá) 11 μm，菌絲體內(nèi)充滿泡囊（圖 1C 黑色箭頭所示），且具有流動性，這與終極腐霉有關(guān)的形態(tài)描述[8]相一致。大量的卵孢子和孢子囊分布在葉肉細(xì)胞間或內(nèi)部，卵孢子壁厚 2 ~ 3 μm（圖 1B）。

2.2 掃描電子顯微鏡觀察致病前后金釵石斛根、莖、葉結(jié)構(gòu)變化

2.2.1 金釵石斛植株被病原菌侵染前后的根表面和橫切面顯微結(jié)構(gòu) 由圖 2 可以看出，未被病原菌侵染的金釵石斛植株根的表面結(jié)構(gòu)保持完整（圖 2A），根被細(xì)胞顯示出典型的網(wǎng)狀纖維樣結(jié)構(gòu)，皮層細(xì)胞結(jié)構(gòu)較完整，其體積明顯比根被細(xì)胞大，有較多顆粒樣物質(zhì)（圖 2B 上箭頭），推測為淀粉粒樣的結(jié)構(gòu)，根的中柱髓部（圖 2B 下箭頭）結(jié)構(gòu)也較完整，細(xì)胞排列規(guī)則。被病原菌侵染的金釵石斛植株根的表面分布有大量的病原菌終極腐霉的菌絲（圖 2C 箭頭），病原菌菌絲體穿過根被死亡細(xì)胞表面的各種孔洞，在根部蔓延和穿行，交織成網(wǎng)狀，進(jìn)而深入根皮層細(xì)胞，破壞皮層細(xì)胞的細(xì)胞壁而導(dǎo)致細(xì)胞的壞死（圖 2C，D），終極腐霉高密度分布是宿主植物發(fā)病的基礎(chǔ)，同時說明這種土傳植物病害病原菌終極腐霉首先必須在基質(zhì)中侵入根部組織進(jìn)而侵染其他組織導(dǎo)致植株的發(fā)病和死亡，這為我們提供了終極腐霉侵染植株直觀的顯微依據(jù)。

2.2.2 金釵石斛植株被病原菌侵染前后的莖表面顯微結(jié)構(gòu) 由圖 3 可以看出，未被病原菌侵染的金釵石斛植株莖表面保持完整的結(jié)構(gòu)，莖葉鞘部位細(xì)胞縱向分布，排列極其規(guī)則，散在分布有氣孔樣結(jié)構(gòu)（圖 3A）。金釵石斛植株受到病原菌侵染后，終極腐霉菌絲大量在莖表面穿行（圖 3B 白色箭頭)、縱橫交錯，使該部位的結(jié)構(gòu)完整性受到嚴(yán)重破壞，莖表面出現(xiàn)了大大小小的孔洞；金釵石斛莖表面的終極腐霉菌絲產(chǎn)生分支（圖 3B 黑色*）后，通過機(jī)械穿透作用進(jìn)入組織內(nèi)部（圖 3B 白色*），后又穿行暴露于莖表面（圖 3B 黑色**）；終極腐霉菌絲出現(xiàn)不規(guī)則膨大，形成附著胞，并牢牢地黏附在莖表面（圖 3B 黑色箭頭)，并將繼續(xù)侵染植株的深部組織。

圖 1 水壓片法觀察被終極腐霉病原菌侵染前后的金釵石斛葉片部位的顯微結(jié)構(gòu)[A：健康葉片，比例尺：10 μm；B：感染終極腐霉 48 h 后金釵石斛葉肉組織中，大量卵孢子形成（箭頭所示），比例尺：10 μm；C：感染終極腐霉 48 h 在葉肉組織中生長旺盛的終極腐霉菌絲，含有豐富的泡囊結(jié)構(gòu)，比例尺：10 μm]

Figure 1 Microstructure of theleaf area before and afterinfection using free-hand sectioning [A: The healthy leaf withoutinfection, scar bar, 10 μm; B: After being infected byfor 48 hrs, a lot of oospores (black arrow) and sporangia indicated by the arrow were found inmesophyll tissue, scar bar, 10 μm; C: After being infected byfor 48 hrs,mycelia grew vigorously in the mesophyll tissue with abundant vesicles, scar bar, 10 μm]

圖 2 掃描電鏡觀察金釵石斛植株被軟腐病病原菌侵染前后的根部超微結(jié)構(gòu)[A：健康金釵石斛根表面，比例尺：100 μm；B：健康金釵石斛根橫切面，上、下箭頭分別顯示皮層薄壁細(xì)胞（內(nèi)含大量顆粒狀物質(zhì)）和中柱層，比例尺：50 μm；C：被終極腐霉侵染 48 h 后的金釵石斛根表面，箭頭所示為病原菌菌絲體，比例尺：10 μm；D：被終極腐霉侵染 48 h 后的金釵石斛的根橫切面，大量終極腐霉菌絲交織成網(wǎng)狀，比例尺：20 μm]

Figure 2 Ultrastructure of theroot segment before and afterinfection using scanning electronic microscope (A: The healthy root withoutinfection, scar bar, 100 μm; B: The cross section of the healthyroot segment, with the column layer indicated by the lower arrow and the cortex parenchyma cells with a lot of granulated substances indicated by the upper arrow, scar bar, 50 μm; C: After being infected byfor 48 hrs, the pathogenic fungal mycelia existed on the surface of theroot, scar bar, 10 μm; D: After being infected byfor 48 hrs, a lot ofinterwove like mesh, scar bar, 20 μm)

圖 3 掃描電鏡觀察金釵石斛植株被病原菌侵染前后的莖部超微結(jié)構(gòu)[A：健康金釵石斛莖表面，比例尺：60 μm；B：被終極腐霉侵染 48 h 后的金釵石斛莖表面，可見從莖表面進(jìn)入的終極腐霉菌絲（白色箭頭），以及菌絲膨大形成的附著胞結(jié)構(gòu)（黑色箭頭），菌絲分支（黑色*）后穿入莖深部組織（白色*），又穿出莖表面（黑色**），比例尺：10 μm]

Figure 3 Ultrastructure of thestem surface before and afterinfection using scanning electronic microscope [A: The healthy stem surface withoutinfection, scar bar, 60 μm; B: After being infected byfor 48 hrs, the pathogenic fungal mycelia entered inside from the stem surface indicated by the white arrow, the appressorium formed by the swelled mycelia could also be seen (black arrow), the mycelia branched (black *) and penetrated through the stem tissue (white *) and then went out of the stem surface (black **), scar bar, 10 μm]

2.2.3 金釵石斛植株被病原菌侵染的葉背面和橫切面顯微結(jié)構(gòu) 圖 4A 顯示未被病原菌侵染的金釵石斛植株葉部的完整結(jié)構(gòu)，橫切面可以看到完整的維管束結(jié)構(gòu)。圖 4B 顯示許多終極腐霉菌絲末端膨大，縱橫排列，形成類似吸盤的特殊結(jié)構(gòu)（圖4B 黑色箭頭），牢固地附著于葉背面，從多個角度和部位黏附、侵染葉背面。圖 4C 顯示大量病原菌菌絲從氣孔處爭相侵入寄主體內(nèi)。圖 4D 顯示終極腐霉菌絲在氣孔處發(fā)生斷裂后，可見許多泡囊結(jié)構(gòu)，這是終極腐霉的典型特征之一[9]。

圖 4 掃描電鏡觀察金釵石斛植株葉部被病原菌侵染前后的超微結(jié)構(gòu)[A：健康金釵石斛葉橫切處面，比例尺：20 μm；B：被終極腐霉侵染 48 h 后的金釵石斛葉背面，終極腐霉菌絲末端膨大形成吸盤樣結(jié)構(gòu)（黑色箭頭），比例尺：6 μm；C：被終極腐霉侵染 48 h 后的金釵石斛葉背面，比例尺：4 μm；D：被終極腐霉侵染 48 h 后的金釵石斛葉背面，菌絲斷裂處顯示泡囊結(jié)構(gòu)，比例尺：1 μm]

Figure 4 Ultrastructure of theleaf segment before and afterinfection using scanning electronic microscope [A: The healthy cross section of the leaf withoutinfection, scar bar, 20 μm; B: After being infected byfor 48 hrs, the pathogenic fungal mycelia swelled at the end and formed sucker like structures on the back of the leaf indicated by the black arrows, scar bar, 6 μm; C: After being infected byfor 48 hrs, the pathogenic fungal mycelia penetrated through the leaf tissue from the stoma of the back of the leaf, scar bar, 4 μm; D: After being infected byfor 48 hrs, vesicles were seen at the site of the broken mycelia, scar bar, 1μm]

圖 5 掃描電鏡觀察金釵石斛植株被軟腐病病原菌侵染的葉表面超微結(jié)構(gòu)[A：顯示典型的菌絲膨大形成的孢子囊結(jié)構(gòu)，比例尺：4 μm；B：藏卵器和藏精器結(jié)構(gòu)，比例尺：2 μm，C：顯示菌絲體側(cè)向膨大形成的孢子囊結(jié)構(gòu)，比例尺：4 μm]

Figure 5 Ultrastructure of theleaf surface afterinfection using scanning electronic microscope [A: The black arrow indicated the typical sporangium in the middle of the swelled mycelia, scar bar, 4 μm; B: Oogonium (white arrow) and antheridium (black arrow), scar bar, 2 μm; C: The sporangium formed by the swelled mycelia at the side direction, scar bar, 4 μm]

2.2.4 金釵石斛植株被病原菌終極腐霉侵染的葉表面形態(tài)結(jié)構(gòu) 由圖 5 可以看出，葉表面分布的病原菌菌絲體中間出現(xiàn)膨大形成典型的孢子囊結(jié)構(gòu)（圖5A黑色箭頭）。圖 5B 示藏精器（黑色箭頭）和藏卵器（白色箭頭）的結(jié)構(gòu)，它們是終極腐霉病原菌的有性繁殖器官，核配以后形成卵孢子進(jìn)而產(chǎn)生下一代病原菌菌絲體。圖 5C 示菌絲側(cè)生的孢子囊結(jié)構(gòu)，此孢子囊結(jié)構(gòu)也稱為厚垣孢子，其具有抵抗惡劣或極端環(huán)境的能力。

3 討論

病原菌終極腐霉是全球性的重要植物病原菌，可引起多種農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物的病害，給國家造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。終極腐霉侵染石斛屬植物的現(xiàn)象越來越普遍，目前國內(nèi)外對終極腐霉的致病機(jī)制報道較少，侵染寄主的具體過程尚不明確，給該病原菌導(dǎo)致的病害的防治帶來了極大困難。以往的研究表明，終極腐霉能夠產(chǎn)生多種蛋白以及纖維素酶、同工酶等細(xì)胞壁降解酶，導(dǎo)致細(xì)胞壁的降解，從而引起胡蘿卜空斑癥的發(fā)生[10]。本研究系統(tǒng)地研究了終極腐霉感染金釵石斛前后的形態(tài)學(xué)變化，由徒手切片以及掃描電鏡觀察推測，終極腐霉主要通過表皮、氣孔等結(jié)構(gòu)進(jìn)行機(jī)械穿透、形成附著胞以及類似吸盤等特殊形態(tài)結(jié)構(gòu)并分泌降解酶破壞金釵石斛細(xì)胞的細(xì)胞壁及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)，并在細(xì)胞間延伸侵染，使根、莖、葉組織嚴(yán)重破壞，進(jìn)而蔓延發(fā)病。植物病原菌侵染寄主是一個極其復(fù)雜的過程[11]，在今后的研究中，利用膠體金標(biāo)記技術(shù)及熒光標(biāo)記技術(shù)系統(tǒng)地進(jìn)行終極腐霉對金釵石斛不同器官致病性的細(xì)胞化學(xué)研究，以及深入探討終極腐霉與金釵石斛相互作用的分子機(jī)制，不僅有利于終極腐霉致病機(jī)制的揭示，同時為開發(fā)有效的真菌抑制劑提供重要的理論基礎(chǔ)。

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Morphological studies ofinfected by the pathogen of the damping-off disease

XING Yong-mei, LI Xiang-dong, GUO Shun-xing

To investigate the morphological characteristics ofdue to the damping-off disease caused by.

The pathogenic experiment onwas conducted usingspore suspension spraying method. Then the differences of the healthy and the diseasedleaf tissue infected byfor 48 hrs were observed using the free-hand sectioning by microscope. In addition, the different characteristics of the root, the stem and the leaf between the healthy and the diseasedinfected byfor 48 hrs were observed using scanning electronic microscope (SEM).

Due to the observation using free-hand sectioning, the healthy leaf kept intact. However, in the diseased group, a lot ofmycelia were found inside theleaf tissue. There were many oospores and sporangia residing in the mesophyll cells of. The integrity of the mesophyll cells was seriously destroyed. The observation of the scanning electronic microscope indicated that the mesophyll cells, the sheath tissue, the root tip cells and the root sheath were easily infected by the pathogenic fungus. The pathogenic fungal mycelia in the stem digested and degraded the cells, and entered the other tissues. In the root site, the fungal mycelia infected the host plant in the same way as it did in the stem site on the one hand and entered the host plant through the holes of the velamen as well.mycelia went into thethrough the stomas of the surface and the opposite side of the leaf tissue with great destroyed effects. At the same time, the specific structure appressorium formed.

infectsby mechanical penertrating and secreting degraded enzymes to destroy the host cell walls and its internal structure.

DENDROBIUM LOODIGESII; Plant components;; Damping-off disease

GUO Shun-xing, Email: sxguo1986@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.03.008

藥植所創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃資助（IT1302）；教育部博士點(diǎn)基金項目（20131106130002）

郭順星，Email：sxguo1986@163.com

2014-02-27

Author Affiliations: The Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China (XING Yong-mei, GUO Shun-xing); China National Corporation of Traditional and Herbal Medicine, Beijing, 100195, China (LI Xiang-dong)