謝貴各，朱麗，蔣宇，戈梅，倪孟祥

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產(chǎn)蝦青素釀酒酵母工程菌的構(gòu)建

謝貴各，朱麗，蔣宇，戈梅，倪孟祥

210009 南京，中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（謝貴各、倪孟祥）；200240 上海來(lái)益生物藥物研發(fā)中心（朱麗、戈梅）；200240 上海工業(yè)微生物所（蔣宇）

對(duì)釀酒酵母固有的 β-胡蘿卜素代謝途徑進(jìn)行擴(kuò)展，構(gòu)建能夠合成蝦青素的釀酒酵母工程菌。

對(duì)不同來(lái)源的蝦青素合成基因（β-胡蘿卜素羥化酶）與（β-胡蘿卜素酮化酶）進(jìn)行隨機(jī)組合，采用 overlap PCR 技術(shù)構(gòu)建串聯(lián)表達(dá)質(zhì)粒，并將其導(dǎo)入產(chǎn) β-胡蘿卜素釀酒酵母工程菌內(nèi)，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng) HPLC 和 UPLC-MS 鑒定，確定其成分。

構(gòu)建出 8 種TEF1p--ADH1t-PGK1P--CYC1t組合的串聯(lián)表達(dá)模式，其中基因組合分別為11，14 工程菌 HCCB08571、HCCB08572 產(chǎn)生了蝦青素；工程菌 HCCB08566、HCCB08568、HCCB08573 未檢測(cè)到產(chǎn)物蝦青素，而出現(xiàn)了中間產(chǎn)物玉米黃質(zhì)和斑蝥黃質(zhì)。

成功構(gòu)建了產(chǎn)生蝦青素及其中間體的釀酒酵母工程菌。

β 胡蘿卜素； 釀酒酵母菌； β-胡蘿卜素羥化酶； β-胡蘿卜素酮化酶； 蝦青素

蝦青素是一種脂溶性天然類胡蘿卜素，可作為維生素 A 的前體，其抗氧化功能比維生素 E 強(qiáng) 500 倍[1]。蝦青素的自然界來(lái)源非常有限，難以滿足市場(chǎng)需求。其生物合成途徑已基本清晰，先是合成 β-胡蘿卜素[2]，然后在β-胡蘿卜素羥化酶（crtZ）β-胡蘿卜素酮化酶（crtW）兩種酶的催化下[3-5]，經(jīng)不同的中間體，最終生成蝦青素[6]，如圖 1 所示。近年來(lái)，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)蝦青素的研究陸續(xù)發(fā)表，如 Huang 等[7]將分別來(lái)源于，的基因?qū)胛骷t柿，使得蝦青素的產(chǎn)量達(dá)到 16.1 mg/g（DCW）。Lemuth 等[8]將來(lái)源于，PCC 73102 的基因在中表達(dá)，獲得蝦青素產(chǎn)量為 1.4 mg/g（DCW)。Hasunuma 等[5]將來(lái)源于.strain SD212 的基因?qū)霟煵葜?，獲得 0.5% 的蝦青素（DCW)。

本文在課題組前期構(gòu)建的 β-胡蘿卜素釀酒酵母工程菌基礎(chǔ)上，調(diào)取或合成不同來(lái)源的基因，采用 overlap PCR 技術(shù)構(gòu)建成 8 種TEF1p--ADH1t-PGK1P--CYC1t 組合的串聯(lián)表達(dá)模式，以期獲得產(chǎn)蝦青素的釀酒酵母工程菌。

圖 1 β-胡蘿卜素到蝦青素的生物催化途徑

Figure 1 Astaxanthin biosynthesis pathway started from β-carotene

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 本研究所用的菌株 HCCB08526 和質(zhì)粒 pYES/KanX-2 由本實(shí)驗(yàn)室保藏；DH5α 及 pMD19-T 購(gòu)自日本 Takara公司；工程菌pUC571（1基因來(lái)源于）、pUC57-1（1基因來(lái)源于）、pUC57-2（2基因來(lái)源于）、pUC57-2（2基因來(lái)源于）、pUC57-3（3基因來(lái)源于spN81106）、pUC573（3基因來(lái)源于spN81106）、pUC57-（基因來(lái)源于）、pUC57-4（4基因來(lái)源于LMG 20103）、pUC57-4（4基因來(lái)源于sp. SD212）均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要溶液和培養(yǎng)基 抗生素（含 50 mg/ml 氨芐青霉素溶液、50 mg/ml 卡那霉素溶液、200 mg/L G418 溶液）；YPD 培養(yǎng)基（含葡萄糖 2%、酵母提取物 1%、胰蛋白胨 2%、固體培養(yǎng)基添加 2% 瓊脂）和 LB 培養(yǎng)基（含NaCl 1%、胰蛋白胨 1%、酵母提取物 1%、固體培養(yǎng)基添加 2% 瓊脂）。

1.1.3 酶與主要試劑 限制性內(nèi)切酶購(gòu)自日本 Takara 公司；KOD 高保真酶購(gòu)自日本 Toyobo 公司；Frozen EZ yeast Transformation IIT2001 購(gòu)自美國(guó) Zymo research 公司。

1.1.4 本研究所用的引物見(jiàn)表 1。

1.2 方法

1.2.1 pLYXGG1-8 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 用表 1 所示引物，以釀酒酵母基因組為模板擴(kuò)增TEF1p、PGK1P 啟動(dòng)子和 ADH1t 終止子片段，以 1.1.1 所述的亞克隆質(zhì)粒為模板擴(kuò)增不同來(lái)源的、基因，隨后經(jīng) overlap PCR擴(kuò)增出 8 種 TEF1p--ADH1t-PGK1P-組合表達(dá)片段，基因組合信息見(jiàn)表 2，并亞克隆至 T 載體。

將測(cè)序驗(yàn)證正確的亞克隆質(zhì)粒經(jīng)RΙ/Ι 雙酶切后，回收 3000 bp 左右的片段與經(jīng)相同酶切的載體質(zhì)粒 pYES2/KanX-2 連接，構(gòu)建成為重組表達(dá)質(zhì)粒 pLYXGG1-8。

表 1 本研究所用引物

表 2 crtZ-crtW基因的不同組合方式

1.2.2 釀酒酵母工程菌 HCCB08566-08573 的構(gòu)建 重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入 HCCB08526，轉(zhuǎn)化方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行?；罨蟮墓こ叹坎加?YPD + G418（200 mg/L）平板，30 ℃靜置培養(yǎng)2 d，篩選目的菌株。

1.2.3 釀酒酵母工程菌的發(fā)酵和產(chǎn)物檢測(cè) 從培養(yǎng)平板上挑取陽(yáng)性菌落，接入 25 ml YPD 培養(yǎng)基（250 ml 搖瓶），30 ℃，220 r/min培養(yǎng) 48 h。然后將種子液按照 4% 的比例轉(zhuǎn)接到新鮮的 YPD 培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min培養(yǎng) 5 d。發(fā)酵結(jié)束后，提取產(chǎn)物，并用 HPLC 進(jìn)行檢測(cè)[9]。

1.2.4 釀酒酵母工程菌發(fā)酵產(chǎn)物 UPLC-MS 鑒定 HPLC 制備蝦青素樣品中的主要物質(zhì)，旋干濃縮后進(jìn)行 UPLC-MS 分析[10]。

2 結(jié)果

2.1 含不同基因組合表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

從圖 2 可以看出，pLYXGG1-8 基因組合片段長(zhǎng)度均在 3000 bp 左右，與目標(biāo)片段長(zhǎng)度大小一致。

M：1 kb DNA Ladder；1 ~ 8：TEF1p-crtZ-ADH1t-PGK1P-crtW 8 種組合片段（pLYXGG1-8）

Figure 2 Agarose electrophoresis analysis of PCR products of eight combinations

2.2 釀酒酵母工程菌 HCCB08566-08573 構(gòu)建

工程菌HCCB08566-08573 與對(duì)照組 HCCB08526 相比，菌體顏色進(jìn)一步加深，說(shuō)明其產(chǎn)生了更多的類胡蘿卜素成分，如圖 3 所示。

2.3 8 種釀酒酵母工程菌發(fā)酵產(chǎn)物分析

圖 4 中A、B、C 是指發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行 HPLC 檢測(cè)獲得的峰，其保留時(shí)間分別為 7.5、9、11 min。

從 HPLC 結(jié)果可以看出，對(duì)比原始菌株 HCCB08526，工程菌 HCCB08571、HCCB08572 出現(xiàn)多種新物質(zhì)峰。針對(duì) HPLC 出現(xiàn)的 A、B、C 3 個(gè)新物質(zhì)峰進(jìn)行了 UPLC-MS 鑒定，以確定其成分。

A 物質(zhì)的保留時(shí)間為 7.5 min，與蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品一致；從圖 5 的 MS 結(jié)果可以看出[M+H] 597.22，[M+Na]619.37，與蝦青素的相對(duì)分子量596.86 相符，證明該物質(zhì)為蝦青素。

圖 3 工程菌 HCCB08566-08573 與對(duì)照菌 HCCB08526 平板生長(zhǎng)情況

Figure 3 The different growth conditions between engineered strain HCCB08566-08573 and control

⑴ ⑵ ⑶ ⑷

Figure 4 Results of fermentation products of engineeredby HPLC assay

圖 5 A物質(zhì)（蝦青素）質(zhì)譜鑒定結(jié)果

Figure 5 MS results of A (Astaxanthin)

B 物質(zhì)的保留時(shí)間為 9 min，該化合物的 MS 圖譜（圖 6）顯示其分子量為 M+（568.4），與玉米黃質(zhì)一致；其主要離子峰 393、444 等也與玉米黃質(zhì)相符，證明該化合物為玉米黃質(zhì)。

C 物質(zhì)的保留時(shí)間為 11 min，該化合物的 MS 圖譜（圖 7）顯示其分子量為 M+（565.4），與斑蝥黃質(zhì)一致；其主要離子峰 133、363 等也與斑蝥黃質(zhì)相符[11]。證明該化合物為斑蝥黃質(zhì)。

圖 6 B 物質(zhì)（玉米黃質(zhì)）質(zhì)譜鑒定結(jié)果

Figure 6 MS results of B (Zeaxanthin)

圖 7 C物質(zhì)（斑蝥黃質(zhì)）質(zhì)譜鑒定結(jié)果

Figure 7 MS results of C (Canthaxanthin)

由此，我們對(duì) 8 種工程菌相對(duì)于原始菌出現(xiàn)新的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了歸類總結(jié)，見(jiàn)表 3?？傮w來(lái)看，釀酒酵母工程菌較原始菌株 HCCB08526 的單菌落均較大，顏色均加深。HPLC及 UPLC-MS 檢測(cè)結(jié)果表明，工程菌HCCB08566-08573 β-胡蘿卜素的產(chǎn)量有所下降，說(shuō)明基因組合發(fā)揮了催化作用，其中 HCCB08571 和 HCCB08572 檢測(cè)到蝦青素成分，而 HCCB08566、HCCB08568、HCCB08573 沒(méi)有檢測(cè)到蝦青素，但分別檢測(cè)到有中間體玉米黃質(zhì)與斑蝥黃質(zhì)存在。

表 3 HCCB08566-08573 發(fā)酵結(jié)果

3 討論

釀酒酵母作為一種 GRAS 模式生物[12]，其毒性小，生長(zhǎng)速度快，能在簡(jiǎn)單培養(yǎng)基上生長(zhǎng)[13]，是真核基因表達(dá)系統(tǒng)的首選。

本研究首次成功利用 HCCB08526 構(gòu)建了產(chǎn)蝦青素、斑蝥黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)的釀酒酵母工程菌。從中間體的表達(dá)量可以看出，基因1、4、、1、4催化活性相對(duì)較高。不同組合的工程菌分別催化產(chǎn)生了蝦青素、玉米黃質(zhì)及斑蝥黃質(zhì)。未成功合成蝦青素的原因可能是構(gòu)建的工程菌中的酶表達(dá)量不足以完成復(fù)雜的催化過(guò)程；前體物質(zhì)不能積累到足以完成向蝦青素的轉(zhuǎn)化量；、基因與底物的親和力有限等[14]，有待進(jìn)一步研究。

志謝 特別感謝上海醫(yī)藥工業(yè)研究院陳代杰研究員對(duì)本研究的經(jīng)驗(yàn)性指導(dǎo)與建議。

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Construction of recombinantproducing astaxanthin

XIE Gui-ge, ZHU Li, JIANG Yu, GE Mei, NI Meng-xiang

To construct the engineering strain producing astaxanthin by extending β-carotene metabolism pathway in.

,genes of different origins were randomly combinated to construct the tandem expression plasmids through overlap PCR techniques, and then transformed intoto obtain the engineered strain with astaxanthin synthesis. Fermented products were identified by HPLC and UPLC-MS to determine their composition.

8 patterns of gene multimers TEF1p--ADH1t-PGK1P--CYC1t were constructed, but astaxanthin was expressed by the engineered strains HCCB08571 and HCCB08572 with1-1 and1-4 combinations, respectively. The astaxanthin were not detected in the fermentants of the other engineered strains and the intermediates, zeaxanthin and canthaxanthin were found.

strains producing astaxanthin and its intermediates are successfully constructed in this study.

beta carotene; Saccharomyces cerevisiae;;; Astaxanthin

NI Meng-xiang, Email: nimx_2000@yahoo.com.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.06.006

倪孟祥，Email：nimx_2000@yahoo.com.cn

2014-04-03

Author Affiliations: College of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China (XIE Gui-ge, NI Meng-xiang); Shanghai Laiyi Biomedical Research Center, Shanghai 200240, China (ZHU Li, GE Mei); Shanghai Industrial Institute of Microbiology, Shanghai 200240, China (JIANG Yu)