丁建姿，李長(zhǎng)青 ，姬廣磊，姚艷艷，陳曉麗，常麗榮

1.威海長(zhǎng)青海洋科技股份有限公司（榮成 264300）；2.威海青逸未來生物技術(shù)有限公司（榮成 264300）；3.尋山集團(tuán)有限公司（榮成 264300）；4.威海市漁業(yè)技術(shù)推廣站（威海 264200）

巖藻黃質(zhì)（Fucoxanthin）是胡蘿卜素的含氧衍生物，是一種脂溶性色素，在藻類中含量豐富，其含量占類胡蘿卜素總產(chǎn)量的10%以上[1]。研究證明巖藻黃質(zhì)具有抗肥胖、抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥等生理活性[2-4]。Kei等研究發(fā)現(xiàn)巖藻黃質(zhì)及代謝產(chǎn)物巖藻黃質(zhì)醇在小鼠體內(nèi)和體外試驗(yàn)中均可抑制原發(fā)性滲出性淋巴瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而對(duì)正常細(xì)胞幾乎沒有任何不良影響[5]。Woo等研究者發(fā)現(xiàn)巖藻黃質(zhì)可以抑制肝臟的脂肪生成，增加肝臟的脂肪分解。在飼料中添加0.05%巖藻黃質(zhì)可以改善肥胖小鼠的肝臟脂質(zhì)狀況，并具有降血脂和降血糖的作用[6]。Hayato等[7]研究表明巖藻黃質(zhì)可以減輕脂肪組織的炎癥，從而具有抗糖尿病的作用。多種功能發(fā)現(xiàn)使巖藻黃質(zhì)在保健食品、醫(yī)藥、美容等領(lǐng)域具有更廣闊的應(yīng)用前景。

大型褐藻中巖藻黃質(zhì)的含量一般在0.1~1 mg/g，提取率低[8]。大型藻生長(zhǎng)周期比較長(zhǎng)、養(yǎng)殖成本高，且本身多糖含量高，提取純化過程困難，并不是巖藻黃質(zhì)提取的最佳原料。而在海洋微藻中，巖藻黃質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2~26.6 mg/g，比大型褐藻巖藻黃質(zhì)濃度高1~3個(gè)數(shù)量級(jí)[9]。三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum Bohlin）中巖藻黃質(zhì)含量尤其豐富，質(zhì)量分?jǐn)?shù)約15 mg/g，而且三角褐指藻可以利用天然海水進(jìn)行人工培養(yǎng)，不會(huì)競(jìng)爭(zhēng)淡水資源，也不會(huì)占用耕地面積，是極佳的原料來源[10]。

對(duì)于巖藻黃質(zhì)研究主要集中于提取、純化、穩(wěn)定性及生物功能的研究[11-14]。巖藻黃質(zhì)的提取主要針對(duì)大型褐藻，如海帶、羊棲菜、裙帶菜、鼠尾藻和銅藻等[15-19]。利用三角褐指藻提取巖藻黃質(zhì)的研究鮮有報(bào)道。

試驗(yàn)以三角褐指藻為原料，采用超聲輔助有機(jī)溶劑浸提法從三角褐指藻中提取巖藻黃質(zhì)，探究提取劑種類、超聲時(shí)間、超聲溫度、料液比對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響。在單因素基礎(chǔ)上利用響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取工藝，以提取率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，得到最優(yōu)提取工藝。初步對(duì)提取的巖藻黃質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定性研究，探究溫度、光照、氧化劑、抗氧化劑等因素對(duì)巖藻黃質(zhì)穩(wěn)定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三角褐指藻（威海長(zhǎng)青海洋科技股份有限公司）；巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號(hào)3351-86-8，美國(guó)sigma公司）；無水乙醇、抗壞血酸、雙氧水（均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、乙腈（均為色譜純，科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

天平（FA1004，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；真空冷凍干燥器（SCIENTZ-10N，寧波新芝科技股份有限公司）；高效液相色譜儀（LC-20AT，島津）；超聲波清洗儀（SB25-12DTD，寧波新芝科技股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 三角褐指藻巖藻黃質(zhì)提取工藝

取0.05 g三角褐指藻凍干粉加入95%乙醇，料液比1∶1 000（g/mL），在30 ℃條件下超聲60 min（頻率40 kHz、超聲功率500 W），全程避光操作，過濾得到巖藻黃質(zhì)提取液。

1.3.2 巖藻黃質(zhì)測(cè)定方法

參照付志明[20]的高效液相色譜法檢測(cè)。

1.3.3 超聲輔助提取單因素試驗(yàn)

根據(jù)1.3.1的巖藻黃質(zhì)提取工藝流程，探究提取溶劑（甲醇，無水乙醇（≥99.7%），95%乙醇，90%乙醇，丙酮，乙酸乙酯和三氯甲烷），超聲溫度（20，30，40，50和60 ℃），超聲時(shí)間（0，15，30，45，60，90，120和150 min），料液比（1∶200，1∶500，1∶1 000，1∶2 000和1∶4 000（g/mL））等因素對(duì)三角褐指藻巖藻黃質(zhì)提取率的影響。

鹽藻黃質(zhì)提取率=C×V/m×10-6×100% （1）式中：C為巖藻黃質(zhì)提取液質(zhì)量濃度，mg/L；V為提取液體積，mL；m為三角褐指藻凍干粉質(zhì)量，g。

1.3.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝

為綜合考慮試驗(yàn)因素的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇超聲溫度（A）、超聲時(shí)間（B）和料液比（C）3個(gè)因素作為自變量，巖藻黃質(zhì)的提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。三因素三水平編碼見表1，基于Box-Behnken模型設(shè)計(jì)，三因素三水平共設(shè)計(jì)17組試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平及編碼

1.3.5 巖藻黃質(zhì)的穩(wěn)定性研究

試驗(yàn)探究光照（避光，室內(nèi)自然光和室外強(qiáng)光），溫度（4 ℃冰箱，25 ℃室溫，40，50，60，70和80℃），氧化劑（3%和6%雙氧水）和抗氧化劑（0.5%和1.0%抗壞血酸）對(duì)巖藻黃質(zhì)穩(wěn)定性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助提取

2.1.1 巖藻黃質(zhì)HPLC色譜圖

圖1為巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖，巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間為7 min，而樣品在7 min也出現(xiàn)相同的峰。兩者光譜特征峰曲線相同，可以判定兩者為同一物質(zhì)。結(jié)果表明樣品在7 min出現(xiàn)的特征峰應(yīng)為巖藻黃質(zhì)的特征峰。

圖1 巖藻黃質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（a）和樣品的色譜圖（b）

2.1.2 提取溶劑對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響

取0.05 g凍干藻粉，加入不同的提取試劑，料液比1∶1 000（g/mL），30 ℃下超聲提取60 min。圖2為不同試劑做提取劑時(shí)巖藻黃質(zhì)提取率的結(jié)果圖，巖藻黃質(zhì)為脂溶性色素，因此提取溶劑選擇有機(jī)試劑。提取效果順序由大到小依次為95%乙醇＞90%乙醇＞甲醇＞無水乙醇（≥99.7%）＞乙酸乙酯＞丙酮＞三氯甲烷?？紤]到提取率及后期巖藻黃質(zhì)實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)試劑的要求，試驗(yàn)采用95%乙醇作為最終提取試劑。

圖2 不同提取溶劑對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響

2.1.3 超聲溫度對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響

取0.05 g凍干藻粉，加入95%乙醇，料液比1∶1 000（g/mL），在30，40，50和60 ℃條件下超聲60 min，全程避光操作。從圖3中可以看出，隨著超聲溫度升高，巖藻黃質(zhì)提取率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，40℃時(shí)巖藻黃質(zhì)提取率最高，為1.97%。結(jié)果表明，隨著溫度升高，三角褐指藻細(xì)胞壁越容易破裂，內(nèi)溶物易流出，增加巖藻黃質(zhì)與提取溶劑的接觸面積，從而使提取率升高。由于巖藻黃質(zhì)本身極不穩(wěn)定，因此隨著溫度進(jìn)一步提升，巖藻黃質(zhì)易分解，導(dǎo)致提取率降低。

圖3 超聲溫度對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響

取0.05 g凍干藻粉，加入95%乙醇，料液比1∶1 000（g/mL），在30 ℃條件下超聲0，15，30，45，60，90，120和150 min，全程避光操作。從圖4可以看出，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，巖藻黃質(zhì)提取率增加，在45 min時(shí)巖藻黃質(zhì)提取率最高，為2.04%。時(shí)間延長(zhǎng)可以增加巖藻黃質(zhì)與提取溶劑的接觸時(shí)間，提取更佳徹底。但是隨著提取時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，巖藻黃質(zhì)提取率下降。這是由于隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，提取出的巖藻黃質(zhì)長(zhǎng)時(shí)間暴露在空氣中，加速巖藻黃質(zhì)的降解，且提取過程是持續(xù)加熱狀態(tài)，高溫也進(jìn)一步促進(jìn)巖藻黃質(zhì)的降解，因此提取率降低。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響

2.1.5 料液比對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響

取0.05 g凍干藻粉，加入95%乙醇，料液比1∶200，1∶500，1∶1 000，1∶1 500和1∶2 000（g/mL），在30 ℃下超聲60 min，全程避光操作。圖5可以看出，隨著料液比增加，巖藻黃質(zhì)提取率呈現(xiàn)先增加后下降趨勢(shì)。料液比1∶1 000（g/mL）時(shí)提取率最高，為2.15%。這是由于隨著料液比增大，巖藻黃質(zhì)在有機(jī)溶劑體系中的擴(kuò)散范圍增大，兩者充分接觸，提取率增加。料液比大于1∶1 000（g/mL）時(shí)，提取率開始下降，說明增加擴(kuò)散范圍所帶來提取率的提升并非沒有限度，擴(kuò)散趨于平穩(wěn)后，巖藻黃質(zhì)提取率不再增加[21]。有機(jī)溶劑使用量增多，會(huì)造成生產(chǎn)成本增加。

圖5 料液比對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響

2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.2.1 模型及方差分析

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)共17組試驗(yàn)，試驗(yàn)的實(shí)際值和預(yù)測(cè)值結(jié)果如表2所示。將表2得到的結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果如圖3所示。該模型的F值為85.51，模型p值＜0.000 1，結(jié)果表明該模型擬合顯著[22]。失擬項(xiàng)F值為1.51，p值為0.341 2（p＞0.05），說明失擬項(xiàng)不顯著，模型是合適的[23]。模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.991 0，說明巖藻黃質(zhì)提取率的試驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值相近，模型的調(diào)整相關(guān)系數(shù)R2為0.979 7，說明巖藻黃質(zhì)提取率模型能在97.97%程度上解釋試驗(yàn)結(jié)果，該二次多元方程擬合度較好。綜合各參數(shù)表明運(yùn)用響應(yīng)曲面法得到的二次方程模型準(zhǔn)確、合適，可用于分析關(guān)于巖藻黃質(zhì)提取率的3個(gè)因素水平，并且可以預(yù)測(cè)最佳巖藻黃質(zhì)提取率。

從表3可以看出：因素A、因素B一次項(xiàng)，二次項(xiàng)A2、B2、C2及相互作用AB對(duì)響應(yīng)值巖藻黃質(zhì)提取率的影響極顯著（p＜0.01），因素C及相互作用AC對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率的影響顯著（p＜0.05）；BC相互作用對(duì)巖藻黃質(zhì)影響效果不顯著；運(yùn)用Design Expert 8.0.5軟件對(duì)表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)二次多元回歸擬合，得到以巖藻黃質(zhì)提取率為響應(yīng)值（Y），因素A、B、C為自變量的二次多項(xiàng)式回歸方程。Y=2.21-0.088A-0.091B+0.042C-0.110AB+0.051AC-0.032BC-0.39A2-0.079B2-0.27C2。Y，巖藻黃質(zhì)提取率（%）。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

2.2.2 響應(yīng)曲面分析及最佳提取工藝選擇

圖6為任意2個(gè)因素之間的相互作用對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率影響的三維圖，每個(gè)因素對(duì)巖藻黃質(zhì)的提取率都有一定影響。圖6中的三維圖開口均朝下，隨著每個(gè)因素?cái)?shù)值增大，巖藻黃質(zhì)提取率先達(dá)到最高值后再下降。結(jié)果表明，3個(gè)因素取值達(dá)到最優(yōu)條件時(shí)，可獲得巖藻黃質(zhì)最佳提取率。3個(gè)因素中超聲時(shí)間對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率影響最大，超聲溫度次之，且超聲溫度與超聲時(shí)間之間的相互作用對(duì)巖藻黃質(zhì)提取率影響較大。

圖6 響應(yīng)曲面分析

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)，優(yōu)化選擇最佳提取條件，得到最大巖藻黃質(zhì)提取率。優(yōu)化結(jié)果為超聲溫度39.77 ℃、超聲時(shí)間42.48 min、料液比1∶1 054.1（g/mL），理論上提取率為2.24%?？紤]到實(shí)際操作的可行性、方便性及節(jié)省能耗等問題，對(duì)參數(shù)條件進(jìn)行優(yōu)化。最佳提取條件為超聲溫度39.8 ℃、超聲時(shí)間43 min、料液比1∶1 055（g/mL），對(duì)工藝優(yōu)化后參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，試驗(yàn)結(jié)果表明巖藻黃提取率為2.18%，證明相應(yīng)曲面分析法優(yōu)化結(jié)果提取工藝參數(shù)具有穩(wěn)定性和可行性。

2.3 巖藻黃質(zhì)的穩(wěn)定性研究

2.3.1 光照對(duì)巖藻黃質(zhì)穩(wěn)定性的影響

取同等體積的巖藻黃質(zhì)提取液于比色管中，封住管口，分別放置在避光、室內(nèi)自然光（1 500~3 000 lx）和室外強(qiáng)光（25 000~35 000 lx）的環(huán)境中，測(cè)定8 h內(nèi)巖藻黃質(zhì)含量變化。結(jié)果如圖7所示，光照對(duì)巖藻黃質(zhì)含量影響很大。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，3種光照條件下，巖藻黃質(zhì)的損失都在增加。避光條件對(duì)巖藻黃質(zhì)含量影響較小，室內(nèi)自然光和室外條件下可明顯看出，巖藻黃質(zhì)含量呈直線下降趨勢(shì)。放置8 h時(shí)后，自然光條件下巖藻黃質(zhì)損失55%左右。室外強(qiáng)光條件下，巖藻黃質(zhì)分解迅速，4 h時(shí)測(cè)定時(shí)巖藻黃質(zhì)含量為0，巖藻黃質(zhì)完全分解。這主要是由于巖藻黃質(zhì)中有含氧多稀結(jié)構(gòu)[24]，穩(wěn)定性差，光照會(huì)促進(jìn)其分解，導(dǎo)致巖藻黃質(zhì)含量下降，因此在日常保存時(shí)應(yīng)避免光照。

圖7 光照對(duì)巖藻黃質(zhì)穩(wěn)定性的影響

2.3.2 溫度對(duì)巖藻黃質(zhì)穩(wěn)定性的影響

取同等體積的巖藻黃質(zhì)提取液于比色管中，封住管口，分別置于4 ℃冰箱，25 ℃室溫，40，50，60，70和80 ℃水浴中，全程避光，測(cè)定24 h內(nèi)巖藻黃質(zhì)的含量變化。結(jié)果如圖8所示，隨著溫度升高，巖藻黃質(zhì)含量逐漸降低。50 ℃以下巖藻黃質(zhì)損失相對(duì)較少，放置在4 ℃冰箱下，巖藻黃質(zhì)損失最少，基本沒有損失。25 ℃室溫條件下巖藻黃質(zhì)損失次之，損失近12%。溫度達(dá)到60 ℃后巖藻黃質(zhì)損失速率加快。60 ℃時(shí)巖藻黃質(zhì)損失近60%，80 ℃放置24 h后，巖藻黃質(zhì)基本完全降解。試驗(yàn)結(jié)果與劉麗平[25]的研究結(jié)果一致，說明高溫下，巖藻黃質(zhì)極不穩(wěn)定。結(jié)果表明，高溫會(huì)破壞巖藻黃質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，造成巖藻黃質(zhì)的降解，因此在日常應(yīng)選擇低溫保存，損失率會(huì)降低。

圖8 溫度對(duì)巖藻黃質(zhì)穩(wěn)定性的影響

2.3.3 氧化劑和抗氧化劑對(duì)巖藻黃質(zhì)穩(wěn)定性的影響

取同等體積的巖藻黃質(zhì)提取液于比色管中，封住管口，在室溫條件下（25 ℃）分別加入氧化劑（3%和6%雙氧水）和抗氧化劑（0.5%和1.0%抗壞血酸），取1組不加氧化劑和抗氧化劑的提取液作為對(duì)照，全程避光操作，測(cè)定24 h內(nèi)巖藻黃質(zhì)的含量變化。從圖9（a）可以看出，與對(duì)照相比，加入H2O2的試驗(yàn)組巖藻黃質(zhì)損失量大，而且隨著H2O2濃度增加，巖藻黃質(zhì)損失量也在增加。結(jié)果表明，巖藻黃質(zhì)在氧化劑存在的條件下不穩(wěn)定，也表明巖藻黃質(zhì)有抗氧化的作用。圖9（b）為加入抗壞血酸后巖藻黃質(zhì)剩余量隨著時(shí)間的變化曲線圖，加入抗氧化劑巖藻黃質(zhì)的損失量減少，并且明顯小于對(duì)照，而且添加1.0%抗壞血酸的試驗(yàn)組巖藻黃質(zhì)基本沒有損失。結(jié)果表明，樣品中加入適量的抗氧化劑，可以減緩巖藻黃質(zhì)氧化，樣品存儲(chǔ)更加穩(wěn)定。

圖9 氧化劑（a）和抗氧化劑（b）對(duì)巖藻黃質(zhì)穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論

三角褐指藻是一種巖藻黃質(zhì)含量豐富的硅藻，通過超聲輔助法從三角褐指藻凍干粉中提取巖藻黃質(zhì)。探究單因素（溶劑種類、超聲溫度、超聲時(shí)間和料液比）對(duì)巖藻黃質(zhì)提取的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得出巖藻黃質(zhì)提取的最優(yōu)工藝，并根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。巖藻黃質(zhì)本身性質(zhì)不穩(wěn)定，因此初步探究光照、溫度、氧化劑和抗氧化劑對(duì)巖藻黃質(zhì)穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，巖藻黃質(zhì)最優(yōu)提取工藝為：料液比1∶1 055（藻粉∶95%乙醇，g/mL），在39.8 ℃水浴下超聲提取43 min。在此條件下，巖藻黃質(zhì)提取率為2.18%。巖藻黃質(zhì)在強(qiáng)光、高溫氧化劑存在的條件下不穩(wěn)定、易分解，容易造成巖藻黃質(zhì)損失，因此平時(shí)儲(chǔ)存時(shí)應(yīng)低溫避光保存，并與氧化劑分開；在抗氧化劑存在的條件下可以降低巖藻黃質(zhì)的損失，因此在存儲(chǔ)時(shí)可以考慮加入抗氧化劑。