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      紅芪與黃芪中兩個(gè)異黃酮類成分含量的比較研究△

      2014-11-02 05:43:32李成義王燕強(qiáng)正澤李碩
      中國現(xiàn)代中藥 2014年7期
      關(guān)鍵詞:芒柄紅芪毛蕊

      李成義,王燕,強(qiáng)正澤,李碩

      (甘肅中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,甘肅 蘭州 730000)

      紅芪與黃芪中兩個(gè)異黃酮類成分含量的比較研究△

      李成義,王燕,強(qiáng)正澤,李碩*

      (甘肅中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,甘肅 蘭州 730000)

      目的通過高效液相色譜法,對(duì)紅芪和黃芪藥材進(jìn)行鑒別和定量分析,為藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。方法色譜柱為TC-C18(2)柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),TC-C18保護(hù)柱(10 mm× 4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為乙腈-0.01%磷酸水溶液(梯度洗脫),流速為1.0 mL·min-1,檢測波長為248 nm,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果15批紅芪樣品中芒柄花素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于毛蕊異黃酮,其中芒柄花素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在77.51~424.94 μg·g-1,毛蕊異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2.27~26.13 μg·g-1;而7批黃芪中芒柄花素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于毛蕊異黃酮,其中芒柄花素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在4.84~29.94 μg·g-1,毛蕊異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在12.95~62.98 μg·g-1。結(jié)論毛蕊異黃酮和芒柄花素的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)可作為紅芪與黃芪的定性鑒別和質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要特征之一。

      紅芪;黃芪;毛蕊異黃酮;芒柄花素;HPLC

      紅芪(Hedysari Radix)與黃芪(Astragali Radix)均為甘肅主產(chǎn)特色藥材,其分別來源于豆科植物多序巖黃芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.、蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪A.membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根[1]。在中醫(yī)臨床上,紅芪與黃芪均為補(bǔ)氣要藥,具有補(bǔ)氣升陽,固表止汗,利水消腫,生津養(yǎng)血,行滯通痹,托毒排膿,斂瘡生肌的功能,多用于治療氣虛引起的各種病癥[2-3]。中藥紅芪自古與黃芪通用,臨床用藥時(shí)紅黃不分,直到1985年版《中國藥典》始將兩者分列。藥材的傳統(tǒng)鑒別雖簡單易行,但其應(yīng)用范圍相對(duì)較窄,且需積累大量的鑒別經(jīng)驗(yàn)。而高效液相色譜法作為常用的一種現(xiàn)代鑒別方法,其應(yīng)用范圍較廣。通過HPLC法不僅可對(duì)紅芪和黃芪藥材進(jìn)行定性鑒別,還可對(duì)其所含指標(biāo)性成分進(jìn)行定量分析,進(jìn)而對(duì)藥材質(zhì)量作出初步判斷。

      1 材料與儀器

      1.1 材料

      實(shí)驗(yàn)所用22批藥材樣品分別采自甘肅省定西市和隴南市的不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)。經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院李成義教授鑒定,1~15號(hào)樣品為豆科植物多序巖黃芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.的干燥根,16~22號(hào)樣品為蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao的干燥根。

      對(duì)照品毛蕊異黃酮(批號(hào):MUST-13030602)和芒柄花素(批號(hào):MUST-13050801)購于成都曼思特生物科技有限公司,純度均為99%;乙腈(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所,色譜純);甲醇(天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠,分析純);磷酸(天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司,優(yōu)級(jí)純);水(娃哈哈純凈水)。

      1.2 儀器

      Agilent 1200型高效液相色譜儀(安捷倫公司),DAD檢測器(美國);萬分之一AL 104型電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司];十萬分之一OHAUS Corporation DV SERIES型電子天平(奧豪斯儀器有限責(zé)任公司);DJ-02型中藥粉碎機(jī)(上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司);HHS-4S型電熱恒溫水浴鍋(上海宜昌儀器紗篩廠);KQ-250TDB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

      2 方法與結(jié)果

      2.1 色譜條件

      TC-C18(2)色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),TC-C18保護(hù)柱(10 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為乙腈(B)-0.01%磷酸水(A)溶液,梯度洗脫(0~25 min,30%~33% B;25~45 min,33%~36% B),流速為1.0 mL·min-1,檢測波長為248 nm,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣量為10 μL。在此色譜條件下色譜圖分離度良好(見圖1)。

      A.紅芪藥材 B.黃芪藥材 C.對(duì)照品 1.毛蕊異黃酮 2.芒柄花素 圖1 紅芪、黃芪藥材及對(duì)照品HPLC圖

      2.2 溶液配制

      2.2.1 混合對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱取毛蕊異黃酮和芒柄花素對(duì)照品1.13 mg、4.05 mg,分別置于10 mL容量瓶中,加甲醇超聲溶解,定容于10 mL容量瓶中,作為貯備液A、B。分別精密吸取這兩種對(duì)照品貯備液2 mL,用甲醇定容至10 mL,制成混合對(duì)照品溶液C。

      2.2.2 供試品溶液的配制 精密稱取藥材樣品粉末3.000 0 g,置150 mL錐形瓶中,加入甲醇30 mL,于80 ℃水浴回流提取1 h,過濾,濾液減壓回收甲醇至一定量后再以適量甲醇定容至10 mL容量瓶中,進(jìn)樣前以0.45 μm微孔濾膜過濾,作為供試品溶液[4]。

      2.3 線性關(guān)系考察

      分別精密吸取一定量的混合對(duì)照品溶液,將其制成8個(gè)系列濃度的混合對(duì)照品溶液,其中毛蕊異黃酮質(zhì)量濃度為0.226,0.452,2.260,11.300,22.600,33.900,45.200,61.020 μg·mL-1,芒柄花素質(zhì)量濃度為0.810,1.620,8.100,40.500,81.000,121.500,162.000,218.700 μg·mL-1,進(jìn)樣10 μL,測定。以質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo),峰面積積分值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程及其線性范圍,見表1。

      表1 毛蕊異黃酮、芒柄花素成分的線性回歸方程

      2.4 精密度試驗(yàn)

      精密吸取2.2.1項(xiàng)下所制毛蕊異黃酮和芒柄花素的混合對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,按2.1項(xiàng)下色譜條件測定峰面積,其峰面積積分值的RSD值分別為0.05%、0.04%,表明儀器精密度良好。

      2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

      取同一批紅芪藥材的供試品溶液(編號(hào):2013-SY-03),于室溫下放置,分別于0,4,8,12,20,24 h 進(jìn)樣檢測,按2種異黃酮類成分的峰面積積分值分別計(jì)算其RSD值。結(jié)果該樣品中毛蕊異黃酮、芒柄花素的RSD值分別為2.65%、0.72%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

      2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

      取同一批紅芪藥材粉末(編號(hào):2013-SY-03),精密稱取樣品6份,按2.2.2項(xiàng)下方法制成6份供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件分別測定。結(jié)果該樣品中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量的RSD值分別為1.50%、0.76%,表明該方法重復(fù)性良好。

      2.7 加樣回收率試驗(yàn)

      精密稱定已知毛蕊異黃酮和芒柄花素含量的紅芪樣品(編號(hào):2013-SY-03)9份,每份約1.0 g,精密加入一定量的毛蕊異黃酮和芒柄花素對(duì)照品,其加入量分別為該樣品中相應(yīng)成分含量的80%(10.17,222.75 μg)、100%(14.69,263.25 μg)、120%(18.08,303.75 μg),按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果毛蕊異黃酮和芒柄花素回收率的RSD值分別為2.76%、2.52%。

      2.8 紅芪與黃芪樣品中毛蕊異黃酮和芒柄花素的含量測定

      22批樣品的供試品溶液均按2.2.2項(xiàng)下方法制備,按2.1項(xiàng)下所述色譜條件進(jìn)行測定,分別記錄毛蕊異黃酮和芒柄花素相應(yīng)色譜峰的峰面積,然后將色譜峰峰面積代入相應(yīng)的回歸方程,計(jì)算紅芪與黃芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素的質(zhì)量分?jǐn)?shù),結(jié)果見表2。

      表2 紅芪、黃芪藥材中毛蕊異黃酮、芒柄花素的測定

      2.9 紅芪中毛蕊異黃酮與芒柄花素含量的線性關(guān)系分析[6]

      毛蕊異黃酮與芒柄花素為紅芪藥材中兩個(gè)主要的異黃酮類成分,通過SPSS 17.0軟件對(duì)15批樣本的相關(guān)系數(shù)(r=0.663)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),P<0.01,說明紅芪藥材中毛蕊異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)與芒柄花素質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間存在線性關(guān)系。在線性擬合時(shí)以毛蕊異黃酮為自變量,芒柄花素為因變量,應(yīng)用最小二乘法可得表2中所有紅芪樣品數(shù)據(jù)的擬合圖(見圖2)及一元線性回歸方程:Y=48.412+9.478X。通過對(duì)該回歸方程的F檢驗(yàn),P<0.01,說明此回歸方程有意義。

      圖2 紅芪中毛蕊異黃酮與芒柄花素質(zhì)量分?jǐn)?shù)關(guān)系擬合圖

      3 討論

      從表2可以看出15批紅芪樣品中芒柄花素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于毛蕊異黃酮,其中芒柄花素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在77.51~424.94 μg·g-1,毛蕊異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2.27~26.13 μg·g-1;而7批黃芪中芒柄花素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于毛蕊異黃酮,其中芒柄花素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在4.84~29.94 μg·g-1,毛蕊異黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在12.95~62.98 μg·g-1。此特點(diǎn)可作為紅芪與黃芪鑒別及質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要特征之一。

      通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,表明本實(shí)驗(yàn)所采用的測定紅芪與黃芪藥材中2個(gè)化合物含量的鑒別方法簡便、可靠、準(zhǔn)確,且具有一定的實(shí)用性,可用于紅芪與黃芪的定性定量鑒別。

      通過對(duì)樣本紅芪中毛蕊異黃酮與芒柄花素含量的線性關(guān)系分析,證明紅芪中毛蕊異黃酮含量與芒柄花素含量之間存在線性關(guān)系。該線性關(guān)系的建立可在僅知道某一種成分含量的情況下對(duì)另一種成分的含量進(jìn)行初步估算。

      毛蕊異黃酮和芒柄花素為紅芪與黃芪藥材中的指標(biāo)成分,均具有抗腫瘤、抗氧化、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、防止骨質(zhì)疏松及神經(jīng)保護(hù)等作用。近年來,有學(xué)者對(duì)紅芪和黃芪中兩個(gè)異黃酮類成分與藥效的相關(guān)性及兩成分藥效間的差異性進(jìn)行了初步研究,發(fā)現(xiàn)芒柄花素是廣泛存在于自然界的一種具有類雌二醇分子結(jié)構(gòu)的化合物,具有弱雌激素樣作用,可促進(jìn)乳腺發(fā)育,保護(hù)心血管系統(tǒng),改善血脂紊亂,降低總膽固醇,抑制腸平滑肌收縮及促進(jìn)傷口愈合等作用[6-8];

      毛蕊異黃酮具有防止腎臟纖維化[9]和保護(hù)腦細(xì)胞[10]等作用;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞能力和抗氧化能力強(qiáng)于芒柄花素[11-12]。但目前有關(guān)中藥紅芪與黃芪中芒柄花素和毛蕊異黃酮的藥效與藥材質(zhì)量相關(guān)性研究的報(bào)道尚不多見,有待進(jìn)一步研究。

      [1] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].一部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:142,283-284.

      [2] 權(quán)菊香.紅芪的藥理研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,1997,8(2):178-180.

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      [4] 梁麗娟,趙奎君,屠鵬飛,等.HPLC法同時(shí)測定黃芪中4種黃酮類成分的含量[J].中國藥房,2010,21(15):1385-1387.

      [5] 張志華,馬友平.恩施州土壤中總硒含量和水溶性硒含量間關(guān)系研究[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào),2008,26(3):287-290.

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      ComparativeStudyofFormononetinandCalycosinContentinHedysariRadixandAstragaliRadix

      LIChengyi,WANGYan,QIANGZhengze,LIShuo*

      (GansuCollegeofTraditionalChineseMedicine,Lanzhou730000,China)

      Objective:To do identification and qualitative analysis on Hedysari Radix and Astragali Radix by HPLC,and provide a scientific basis for the quality evaluation.MethodsThe sample was separated on TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm)column.The mobile phase consisted of acetonitrile and 0.01%phosphoric acid solution(gradient elution)at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The UV detection wave length was set at 248 nm.The column temperature was set at 30 ℃.The injection volume was 10 μL.ResultsFormononetin content was higher than calycosin in Hedysari Radix.Formononetin content was between 77.51~424.94 μg·g-1,and calycosin between 2.27~26.13 μg·g-1,but the contents in Astragali Radix were exactly opposite.Formononetin content was between 4.84~29.94 μg·g-1,and calycosin between 12.95~62.98 μg·g-1.ConclusionThe relative content of formononetin and calycosin can be main features of qualitative identification and quality evaluation on Hedysari Radix and Astragali Radix.

      Hedysari Radix;Astragali Radix;Calycosin;Formononetin;HPLC

      國家自然科學(xué)基金委員會(huì)資助項(xiàng)目(地區(qū)科學(xué)基金項(xiàng)目)——甘肅地產(chǎn)藥材紅芪道地性與生態(tài)因子的相關(guān)性研究(81360621)

      *

      李碩,講師,研究方向:中藥品種與質(zhì)量研究;Tel:(0931)8765385,E-mail:29068323@qq.com

      10.13313/j.issn.1673-4890.2014.07.004

      2014-05-04)

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