張延紅，高素芳，陳紅剛，李應(yīng)東

(甘肅中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，甘肅 蘭州 730000)

“十二五”國家科技支撐計劃課題(2011BAI05B02)

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張延紅，副教授，研究方向：藥用植物育種和組織培養(yǎng)；Tel：18909449018，E-mail：zhyh456789@163.com

當(dāng)歸不定根的誘導(dǎo)研究△

張延紅*，高素芳，陳紅剛，李應(yīng)東

(甘肅中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，甘肅 蘭州 730000)

目的建立不定根誘導(dǎo)技術(shù)體系，為當(dāng)歸不定根的大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。方法以當(dāng)歸種子無菌發(fā)芽小苗和休眠芽為試驗材料，研究培養(yǎng)基種類、有機物組分及激素組合對當(dāng)歸不定根誘導(dǎo)和生長的影響。結(jié)果最佳的不定根誘導(dǎo)外植體是休眠芽葉片、胚軸和根；不同VB1和VB6濃度比例對當(dāng)歸不定根生長的影響顯著，其中VB11.0 mg·L-1和VB60.5 mg·L-1組合誘導(dǎo)效果最佳，適當(dāng)提高VB1濃度可以促進當(dāng)歸不定根的誘導(dǎo)；IBA 0.5 mg·L-1+IAA 2.0 mg·L-1激素組合適宜于不定根誘導(dǎo)。結(jié)論建立了當(dāng)歸不定根誘導(dǎo)的技術(shù)體系。

當(dāng)歸；組織培養(yǎng)；不定根；誘導(dǎo)；繼代培養(yǎng)

當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels為傘形科當(dāng)歸屬多年生草本植物，以根入藥，是我國常用名貴中藥材之一，具有補血活血、抗缺氧，調(diào)節(jié)機體免疫、抗動脈硬化、護膚美容等作用[1]。全國有85%以上的當(dāng)歸產(chǎn)自甘肅，當(dāng)歸是甘肅的特色道地藥材。隨著國際和國內(nèi)市場對當(dāng)歸需求量的日益增加，野生當(dāng)歸已難覓蹤跡，而當(dāng)歸的栽培對于自然條件的要求又很嚴(yán)格，同時生產(chǎn)中又存在著早期抽薹和多種病蟲害等難題，嚴(yán)重影響其藥材的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)[2]。不定根培養(yǎng)是采用植物組織培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)根類藥材的根；不定根培養(yǎng)具有生長周期短、條件可控、遺傳背景一致、經(jīng)濟方便、重復(fù)性強、效率高和可周年生長等優(yōu)點，可以快速大量獲得藥用植物不定根及次生代謝產(chǎn)物，從而有效的解決資源不足等問題[3]。因此，藥用植物不定根培養(yǎng)是開發(fā)中藥資源的一條有效途徑。本研究采用植物組織培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)產(chǎn)生不定根，旨在為當(dāng)歸不定根的大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

先將當(dāng)歸種苗的休眠芽從基部切下，根切成4～5 cm的小段。然后將休眠芽、根段和種子先用自來水沖洗30 min，然后用75%乙醇滅菌10 s，再用0.1%升汞滅菌(休眠芽和種子滅菌5 min，根段滅菌10 min)，最后用無菌水沖洗3遍，用無菌濾紙吸干表面水分。將休眠芽和種子接種于1/2 MS培養(yǎng)基中，待萌發(fā)后取休眠芽葉片，發(fā)芽小苗的子葉、胚軸和胚根作外植體。將根段切成1～2 mm厚的薄片作外植體。

1.2 試劑

大量元素；微量元素，有機元素，激素及其它化學(xué)藥品和試劑均為進口或國產(chǎn)分析純以上。

1.3 儀器

超凈工作臺(蘇州凈化SW-SJ-1D)；高壓滅菌鍋(上海申安LDZX-30KBS)；人工氣候箱(南京貝蒂BD-PGX)；酸度計(意大利哈納HI98127)；電子天平(德國賽多利斯BSA623S)。

2 方法

2.1 不同培養(yǎng)基類型誘導(dǎo)當(dāng)歸根片生根

以當(dāng)歸根片為外植體，MS和1/2 MS(無機鹽減半)為基本培養(yǎng)基，添加IBA、KT、IBA、NAA、IAA和2，4-D，單獨或配比使用，蔗糖含量30 g·L-1，瓊脂含量7 g·L-1，pH 5.8，誘導(dǎo)不定根產(chǎn)生。

2.2 不同VB1 和VB6濃度誘導(dǎo)生根

以當(dāng)歸休眠芽葉片為外植體，1/2 MS(無機鹽減半)為基本培養(yǎng)基，改變VB1和VB6濃度比例，添加2.0 mg·L-1IAA和0.5 mg·L-1IBA，誘導(dǎo)不定根產(chǎn)生。

2.3 不同基本培養(yǎng)基和激素組合對誘導(dǎo)生根的影響

將無菌小苗切割成胚根、胚軸和子葉三種外植體，接種于1/2 MS(無機鹽減半)和1/2 B5(無機鹽減半)，同時附加兩種不同種類和濃度的激素培養(yǎng)基中(見表1)，誘導(dǎo)不定根產(chǎn)生。

表1 胚根、胚軸和子葉誘導(dǎo)不定根的培養(yǎng)基配方

注：“-”表示沒有加入激素

2.4 不定根的繼代培養(yǎng)

將以休眠芽葉片為外植體，誘導(dǎo)獲得的不定根繼代于1/2 MS(無機鹽減半)為基本培養(yǎng)基(維生素濃度組合為1.0 mg·L-1VB1和0.5 mg·L-1VB6)，添加2.0 mg·L-1IAA和0.5 mg·L-1IBA的培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，1個月后進行觀察統(tǒng)計。

2.5 培養(yǎng)條件

將接種好的材料放入人工氣候箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為23 ℃，濕度70%，光照時間14 h·d-1，光照強度2 000 lx。

2.6 結(jié)果統(tǒng)計

以不定根誘導(dǎo)率、根粗細(xì)、根條數(shù)為主要考察指標(biāo)，結(jié)合愈傷組織情況進行統(tǒng)計。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同培養(yǎng)基類型對當(dāng)歸根片不定根誘導(dǎo)的影響

表2 不同培養(yǎng)基類型對當(dāng)歸根片不定根的誘導(dǎo)

續(xù)表2

注：大根片是指粗壯種苗根的中上部(直徑約為1～1.5 cm)；小片指細(xì)小種苗的根片；“+++”表示多，“++”表示較多，“+”表示少，“-”表示無；同列內(nèi)相同字母表示鄧肯氏新復(fù)極差檢驗在P=0.05水平上差異不顯著，下同。

由表2可以看出，以當(dāng)歸根片為外植體，MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度IBA和KT誘導(dǎo)不定根。結(jié)果表明IBA濃度在1～3 mg·L-1之間，均產(chǎn)生大量愈傷組織，呈綿軟狀，淡黃色或紫色，根片上有放射線狀突起。當(dāng)IBA為0.5 mg·L-1時，根片上沒有愈傷組織，但仍有放射狀根突起。當(dāng)IBA為0.3 mg·L-1時誘導(dǎo)生根效果最好，0.1 mg·L-1時發(fā)根數(shù)量又減少。因此，低濃度的IBA利于不定根的直接發(fā)生，相反，高濃度的激素及其配比利于愈傷組織產(chǎn)生，但阻礙根的發(fā)生。以NAA誘導(dǎo)不定根，結(jié)果表明，NAA均可誘導(dǎo)愈傷產(chǎn)生，但愈傷量普遍較少。NAA濃度高時，愈傷呈現(xiàn)淡黃色，綿軟狀，低時，愈傷呈現(xiàn)淡紫色。以MS為基本培養(yǎng)基，附加2，4-D和KT兩種激素，進行不定根誘導(dǎo)，結(jié)果表明2，4-D在1～2 mg·L-1之間配合使用不同濃度的KT均可誘導(dǎo)產(chǎn)生較多的愈傷組織，2，4-D和KT之間的比值較小時，愈傷多為淡黃褐，膨化致密狀。在同一培養(yǎng)基中大根片誘導(dǎo)效果好，愈傷量多，小根片反應(yīng)較弱，誘導(dǎo)效果不良。這可能是因為大根片內(nèi)源激素含量較高，容易啟動細(xì)胞分裂。

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，添加不同種類和濃度的生長素進行根誘導(dǎo)，結(jié)果表明1/2 MS+IBA 0.5 mg·L-1+IAA 2.0 mg·L-1誘導(dǎo)不定根的效果很好，每根片上直接誘導(dǎo)產(chǎn)生12條白色較透亮，長約0.5 cm的根。而1/2 MS+IBA 0.5 mg·L-1培養(yǎng)基中根片四周僅誘導(dǎo)產(chǎn)生許多淡紫色根狀突起，根片膨大。MS+IBA 0.5 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1中也同樣產(chǎn)生許多根狀突起。由此推斷，IBA對根狀突起的誘導(dǎo)起到了決定性的作用，IAA對根的進一步的生長起到了至關(guān)重要的作用。在不同種類和濃度的激素配比中2，4-D誘導(dǎo)愈傷的能力明顯強于其它激素，但不利于根誘導(dǎo)[4]。

3.2 VB1和VB6濃度對當(dāng)歸不定根誘導(dǎo)和生長的影響

表3 VB1和VB6濃度比例對當(dāng)歸不定根誘導(dǎo)和生長的影響

由表3可以看出，以休眠芽葉片為外植體，VB1和VB6不同濃度配比對不定根誘導(dǎo)影響顯著。VB10.1 mg·L-1和VB60.5 mg·L-1濃度配比(即原MS配方濃度)既未誘導(dǎo)產(chǎn)生不定根，也未產(chǎn)生愈傷組織。VB11.0 mg·L-1和VB60.5 mg·L-1濃度配比效果最佳，誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定根數(shù)量最多，平均根條數(shù)14條，平均根長約為0.6 cm，不定根白色；VB10.5 mg·L-1和VB60.5 mg·L-1配比效果次之，不定根數(shù)量為4條，平均根長約為0.4 cm。因此，提高VB1濃度誘導(dǎo)當(dāng)歸不定根的效果顯著。以不同外植體誘導(dǎo)不定根時，休眠芽葉片效果最好，愈傷組織與試管苗效果不良。

6種不同濃度的VB1和VB6配比對當(dāng)歸愈傷組織的誘導(dǎo)和生長的影響也有差異。VB10.5 mg·L-1和VB60.5 mg·L-1與VB10.5 mg·L-1和VB61.0 mg·L-1較對照(VB10.1 mg·L-1和VB60.5 mg·L-1)中的新生愈傷組織量增加較多、顏色與狀態(tài)也較優(yōu)。因此，適當(dāng)增大VB1濃度也有利于當(dāng)歸愈傷組織誘導(dǎo)。

2.3 不同培養(yǎng)基類型誘導(dǎo)當(dāng)歸(根、胚軸和子葉)產(chǎn)生不定根

表4 不同培養(yǎng)基類型對當(dāng)歸(根、胚軸和子葉)不定根誘導(dǎo)的影響

由表4可以看出，1/2 MS+IBA 0.5 mg·L-1+IAA2.0 mg·L-1+蔗糖15 g·L-1+瓊脂7 g·L-1(3號)和1/2 B5+IBA 0.5 mg·L-1+IAA 2.0 mg·L-1+蔗糖15 g·L-1+瓊脂7 g·L-1(4號)培養(yǎng)基誘導(dǎo)當(dāng)歸愈傷組織和不定根生長效果最好，不定根誘導(dǎo)率為100%，不定根條數(shù)也較多，生長狀態(tài)較優(yōu)。不同處理根條數(shù)差異不顯著。IBA 0.5 mg·L-1和IAA 2.0 mg·L-1配比誘導(dǎo)效果優(yōu)于IAA 0.5 mg·L-1和NAA 0.1 mg·L-1。不同的外植體誘導(dǎo)效果差異較大，胚軸與胚根誘導(dǎo)產(chǎn)生不定根的效果較好，子葉枯黃死亡。

2.4 不定根的繼代培養(yǎng)

表5 不定根繼代培養(yǎng)時的生長情況

由表5可以看出，來源于不同VB1和VB6濃度組合的不定根，繼代于1.0 mg·L-1VB1和0.5 mg·L-1VB6組合中，培養(yǎng)1個月后，其中在原培養(yǎng)基中繼代，不定根的生長狀態(tài)最好，無愈傷組織產(chǎn)生，根條數(shù)和根長均最大，但根中花色素苷含量較高，呈現(xiàn)紫色。試驗也將根片誘導(dǎo)獲得的不定根在其原培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，但根枯死或無增殖。目前，繼代后根的生長速度較慢，還有待進一步深入研究。

4 結(jié)論與討論

4.1 適宜的外植體

外植體對于不定根誘導(dǎo)影響顯著。本研究表明，休眠芽葉片、根、胚軸為理想的不定根誘導(dǎo)外植體，愈傷組織、子葉誘導(dǎo)效果不佳。

4.2 適宜的基本培養(yǎng)基和激素配比

本試驗結(jié)果表明，以種子發(fā)芽小苗的胚軸、胚根和子葉為外植體時，B5和MS在不定根誘導(dǎo)時差異不大。IAA 2.0 mg·L-1和IBA 0.5 mg·L-1激素組合誘導(dǎo)效果最佳。

4.3 適宜VB1和VB6濃度組合

植物體在自然條件下，有機物成分是依靠自身的代謝加以調(diào)節(jié)的，而培養(yǎng)的離體組織、細(xì)胞雖能合成必需的維生素，但在數(shù)量上遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足，為了能使組織很好地生長，在培養(yǎng)基中必需補加維生素，一般認(rèn)為VB1、VB6是兩種必需的成分。本研究結(jié)果表明，適當(dāng)提高VB1濃度，有利于不定根和愈傷誘導(dǎo)。1.0 mg·L-1VB1和0.5 mg·L-1VB6組合適宜于不定根誘導(dǎo)，這與番茄不定根誘導(dǎo)的研究結(jié)果相同[5]。

[1] 陳江弢，楊崇仁.當(dāng)歸屬植物的研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2004，(4)：12-14.

[2] 雒曉芳，楊寧，陳學(xué)林，等.當(dāng)歸水培苗的組織培養(yǎng)[J].西北師范大學(xué)報，2004，40(4)：77-79.

[3] 高文遠(yuǎn)，賈偉.藥用植物大規(guī)模組織培養(yǎng)[M]，第一版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

[4] 郭肖紅，高文遠(yuǎn)，李克峰.丹參不定根組織培養(yǎng)的研究[J].中草藥，2007，38(3)：429-432.

[5] 王蒂.植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)[M]，第一版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004.

StudyonAdventitiousRootsInductionofAngelicasinensis(Oliv.)Diels

ZHANGYanhong*，GAOSufang，CHENHonggang，LIYingdong

(DepartmentofPharmacy，GansuCollegeofTraditionalChineseMedicine，Lanzhou730000，China)

Objective：To set up system of adventitious roots induction technology ofAngelicasinensis(Oliv.)Diels，which laid the foundation for its large-scale production.MethodsSeedlings from seeds germination and dormant buds as experimental material，the effects of the organic matter composition，types of culture medium，and hormone combination on adventitious roots induction and growth were studied.ResultsExplants is dormant leaf，hypocotyls and root.Different concentration of VB1and VB6had significant effects on adventitious roots growth，among which the VB11.0 mg·L-1and VB60.5 mg·L-1combination was appropriate，improving VB1concentration can promote adventitious roots induction；0.5 mg·L-1IBA and 2.0 mg·L-1IAA hormone combination was suitable for adventitious roots induction.ConclusionThe technology system of adventitious roots induction ofA.sinensiswas established.

Angelicasinensis(Oliv.)Diels；Tissue culture；Adventitious root；Induction；Subculture

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.05.002

2014-02-03)