高素芳，張延紅

(甘肅中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，甘肅 蘭州 730000)

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃課題(2011BAI05B02)

*

張延紅，副教授，研究方向：藥用植物育種和組織培養(yǎng)；Tel：18909449018，E-mail：hchy456789@163.com

當(dāng)歸愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生研究△

高素芳，張延紅*

(甘肅中醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)系，甘肅 蘭州 730000)

目的探究當(dāng)歸愈傷組織誘導(dǎo)、增殖、胚狀體分化和植株再生的條件，為當(dāng)歸工廠化育苗和轉(zhuǎn)基因育種奠定基礎(chǔ)。方法以胚軸和子葉為外植體，1/2 MS或MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的蔗糖、不同種類和濃度的激素，誘導(dǎo)當(dāng)歸愈傷組織。研究不同的繼代方法和次數(shù)、ABA、IBA及蔗糖濃度對(duì)愈傷增殖和胚狀體分化的影響。結(jié)果愈傷組織第1～5次的繼代及胚狀體分化培養(yǎng)基可采用1/2 MS+IBA 2 mg·L-1+3%蔗糖，愈傷組織第6次之后的繼代和胚狀體分化培養(yǎng)基可采用1/2 MS+IBA 2 mg·L-1+KT 0.2 mg·L-1+3%蔗糖培養(yǎng)基，愈傷組織生長良好，但胚狀體的分化量還有待進(jìn)一步提高。結(jié)論建立了較為完善的當(dāng)歸胚狀體再生植株的技術(shù)體系。

當(dāng)歸；愈傷組織；初代培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)；胚狀體；再生植株

當(dāng)歸是傘形科植物當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根，是我國常用名貴中藥材之一，具有抗缺氧，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗癌、護(hù)膚美容、補(bǔ)血活血、抑菌、抗動(dòng)脈硬化等作用[1]。當(dāng)歸喜氣候涼爽、濕潤的環(huán)境，對(duì)生長環(huán)境有著特殊的要求，其主產(chǎn)地僅為甘肅、云南、青海等省，全國有85%以上的當(dāng)歸產(chǎn)自甘肅[2]。當(dāng)歸生產(chǎn)上常采用育苗移栽，第一年育苗，第二年移栽，第三年進(jìn)入抽薹開花期，留種。當(dāng)歸育苗要選用生荒地，每年砍林開墾新地，這種育苗方式嚴(yán)重破壞了天然植被，同時(shí)還要耗費(fèi)大量的人力物力。當(dāng)歸的組織培養(yǎng)研究開展較早，已進(jìn)行了當(dāng)歸不同器官的組織培養(yǎng)得到愈傷組織并再生植株，但仍存在愈傷誘導(dǎo)率和胚狀體分化率低或培養(yǎng)方法復(fù)雜等問題[3-7]。此外，研究中幾乎都采用2，4-D誘導(dǎo)胚性愈傷組織，目前的研究發(fā)現(xiàn)2，4-D對(duì)人體有毒害作用，應(yīng)避免使用[8]。本研究首次采用IBA誘導(dǎo)獲得當(dāng)歸胚性愈傷組織，誘導(dǎo)率高達(dá)100%，胚狀體分化量多，再生植株表型正常。因此采用該技術(shù)體系可有效地保證用藥的安全性。本試驗(yàn)探討了當(dāng)歸愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖和胚狀體分化條件，旨在建立良好的當(dāng)歸胚狀體再生體系，為當(dāng)歸大規(guī)模細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和工廠化育苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

采自甘肅岷縣的當(dāng)歸種子，經(jīng)無菌發(fā)芽獲得小苗。

1.2 試劑

大量元素；微量元素；有機(jī)元素；激素及其它化學(xué)藥品和試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純以上。

1.3 儀器

超凈工作臺(tái)(蘇州凈化SW-SJ-1D)；高壓滅菌鍋(上海申安LDZX-30KBS)；人工氣候箱(南京貝蒂BD-PGX)；酸度計(jì)(意大利哈納HI98127)；電子天平(德國賽多利斯BSA623S)。

2 方法

2.1 無菌外植體的獲得

將采自岷縣的當(dāng)歸種子先用流水沖洗30 min后，置于濾紙上吸干水分后用70%乙醇和0.1%升汞或2%NaClO滅菌不同時(shí)間，再用無菌水沖洗3遍，用無菌濾紙吸干種子表面的水分，接種于1/2 MS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d后獲得當(dāng)歸種子無菌發(fā)芽小苗。每處理4瓶，每瓶接種3～4粒種子。

2.2 當(dāng)歸愈傷組織誘導(dǎo)

以2.1項(xiàng)下篩選出的最佳滅菌方法(3號(hào))，進(jìn)行當(dāng)歸種子無菌發(fā)芽，以獲得的無菌小苗的胚軸和子葉為外植體，MS或1/2 MS為基本培養(yǎng)基，接種到添加IBA、NAA和KT的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)獲得愈傷組織。每處理4瓶，每瓶接種4～5個(gè)外植體，以下試驗(yàn)均與此相同。

2.3 當(dāng)歸愈傷組織的繼代培養(yǎng)

將b(MS+IBA 2 mg·L-1+KT 0.2 mg·L-1+蔗糖3%)和a(1/2 MS+IBA 2 mg·L-1+蔗糖3%)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)獲得的愈傷組織接種于b或a培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

2.4 當(dāng)歸胚狀體的分化

以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的蔗糖以及不同濃度ABA和IBA誘導(dǎo)胚狀體分化。試驗(yàn)處理：A組：添加1 mg·L-1IBA，設(shè)蔗糖濃度3%、5%、7%、9%；B組：蔗糖濃度為3%，添加1 mg·L-1IBA，ABA設(shè)定4個(gè)濃度梯度：0.5、0.8、1.0、1.5 mg·L-1；C組：蔗糖濃度為3%，IBA設(shè)定4個(gè)濃度梯度：0.1、0.3、0.5、1.0 mg·L-1；D組：設(shè)KT濃度為0.2 mg/L，IBA濃度為0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1和2.0 mg·L-1。培養(yǎng)基中瓊脂用量均為7 g·L-1，pH 5.8。對(duì)照組：1/2 MS培養(yǎng)基中添加1.0 mg·L-1IBA。

2.5 培養(yǎng)條件

將愈傷組織接種于以上培養(yǎng)基中，放入人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為23 ℃，濕度70%，光照時(shí)間14 h·d-1，光照強(qiáng)度2 000 lx。

2.3 結(jié)果統(tǒng)計(jì)

培養(yǎng)30 d后進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)，以污染率、發(fā)芽率、愈傷誘導(dǎo)率、愈傷量和顏色、愈傷狀態(tài)、胚狀體分化量等為主要考察指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

3 結(jié)果與分析

3.1 當(dāng)歸種子無菌發(fā)芽

表1 不同滅菌組合對(duì)當(dāng)歸種子無菌發(fā)芽的影響

注：同列內(nèi)相同字母表示鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)在P0.05水平上差異不顯著。

由表1可知，3號(hào)處理效果最好，污染率為10.6%，發(fā)芽率高達(dá)76.8%，2號(hào)處理與3號(hào)之間差異不顯著。隨著HgCl2滅菌時(shí)間的延長，種子受到的毒害越大，0.1% HgCl2滅菌15 min，污染率為0，發(fā)芽率也為0。因此，當(dāng)歸種子無菌發(fā)芽需2種或3種滅菌劑聯(lián)合使用，否則很難達(dá)到理想的滅菌效果。3號(hào)處理當(dāng)歸種子約2周后才開始發(fā)芽，4周后長成高約4 cm左右，形態(tài)正常的小苗，這與普通培養(yǎng)皿發(fā)芽相比，開始發(fā)芽的時(shí)間推遲了一周。

3.2 愈傷組織的誘導(dǎo)(見表2)

表2 不同培養(yǎng)基和外植體類型誘導(dǎo)愈傷和發(fā)根的情況

注：愈傷組織量用“+”表示，“+”越多表示量越多；“-”表示無增殖或分化；下同。

由表2可以看出，1/2 MS+IBA 2 mg·L-1或IBA 3 mg·L-1和MS+IBA 2 mg·L-1+KT 0.2 mg·L-1(見圖a)培養(yǎng)基中均可誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，較高濃度IBA適于愈傷誘導(dǎo)，愈傷組織量少且呈現(xiàn)土黃色、綿軟狀。IBA濃度太低，外植體無反應(yīng)。3 mg·L-1NAA無法誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生愈傷。子葉和胚軸相比較，胚軸誘導(dǎo)后產(chǎn)生愈傷和不定根，是較好的外植體，子葉誘導(dǎo)效果普遍不好。

圖a 胚軸誘導(dǎo)獲得的愈傷組織

3.3 當(dāng)歸愈傷組織的繼代培養(yǎng)與胚狀體分化(見表3、表4)

表3 當(dāng)歸愈傷組織2次繼代后的生長和分化情況

注：“+”代表愈傷量和胚狀體的數(shù)量，“+”越多，表示數(shù)量越多；“-”表示無增殖或分化；下同。

表4 當(dāng)歸愈傷組織3次繼代后的生長和分化情況

試驗(yàn)以當(dāng)歸種子發(fā)芽小苗為材料來源，以胚軸為外植體，初代培養(yǎng)產(chǎn)生愈傷組織，然后用a或b培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，結(jié)果表明，少量土黃色愈傷組織第一次繼代后，普遍生長較緩慢。2次繼代后愈傷生長較快，愈傷狀態(tài)和分化情況差異較大。以當(dāng)歸胚軸為外植體，先在b培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，然后轉(zhuǎn)入a培養(yǎng)基中繼代2次(即b-a-a)，產(chǎn)生了一定量的黃白色顆粒狀愈傷組織，同時(shí)在其表面分化出較多胚狀體，并再生植株(見圖b)。在b-a-a-a的繼代流程中，產(chǎn)生了大量白色顆粒狀愈傷組織和胚狀體。多數(shù)胚狀體開始萌發(fā)生長，胚根伸長，抽出2～3片綠色真葉，再生試管苗形態(tài)和種子發(fā)芽小苗相同(見圖c)。

圖b 2次繼代后(b-a-a)的愈傷組織

圖c 3次繼代后(b-a-a-a)分化出大量的試管苗

在b-b-b和a-a-a的繼代流程中，愈傷增殖量不多，呈現(xiàn)白色透明、綿軟狀。其中a-a-a中有少量胚狀體分化。在a-a-a-a的3次繼代流程中，愈傷增殖量中等，但胚狀體的分化量明顯增多。在b-b-b-b的3次繼代流程中愈傷增殖量中等，呈現(xiàn)土黃色，疏松顆粒狀，并分化出少量芽，無明顯的根分化。其原因可能是b培養(yǎng)基中無機(jī)鹽濃度過高，抑制了根的分化。在愈傷組織培養(yǎng)時(shí)普遍表現(xiàn)出培養(yǎng)早期生長速度較慢，隨著繼代次數(shù)的增加，當(dāng)歸愈傷增殖速度加快，約半個(gè)月就長滿培養(yǎng)基表面，同時(shí)胚狀體的分化量也明顯增多。經(jīng)過6～7次繼代后，愈傷組織顏色由淡黃綠色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榈S褐色，愈傷增殖速度仍非?？?，但胚狀體的分化量降低。為了提高胚狀體的分化量，又進(jìn)一步作了以下處理。

3.4 不同蔗糖濃度對(duì)當(dāng)歸愈傷組織增殖和胚狀體分化的影響(見表5)

表5 不同濃度蔗糖對(duì)當(dāng)歸愈傷組織增殖和胚狀體分化的影響

培養(yǎng)基中的蔗糖濃度對(duì)當(dāng)歸愈傷組織的增殖和胚狀體形成均有顯著影響。在高濃度的蔗糖培養(yǎng)基中愈傷顆粒小，增殖量少，未見成熟的胚狀體。在3%的蔗糖培養(yǎng)基上，愈傷組織為大顆粒，增殖量多，生長狀態(tài)良好，同時(shí)分化形成了少量胚狀體。因此，高濃度的蔗糖濃度反而不利于愈傷組織的增殖和胚狀體的誘導(dǎo)分化。

3.5 不同濃度的ABA對(duì)當(dāng)歸愈傷組織增殖和胚狀體分化的影響(見表6)

表6 不同濃度的ABA對(duì)當(dāng)歸愈傷組織增殖和胚狀體分化的影響

由表6可知，在添加了IBA的培養(yǎng)基上，同時(shí)附加不同濃度的ABA時(shí)，當(dāng)歸愈傷組織的增殖量少，呈白色疏松狀的顆粒，且均無胚狀體的生成。因此，給培養(yǎng)基中加入以上濃度的 ABA并不能促進(jìn)胚狀體的分化，且愈傷組織增殖也受到抑制。

3.6 不同濃度的IBA對(duì)當(dāng)歸愈傷組織增殖和胚狀體分化的影響(見表7)

表7 不同濃度的IBA對(duì)當(dāng)歸愈傷組織增殖和胚狀體分化的影響

由表7可知，在添加了3%蔗糖的1/2 MS基本培養(yǎng)基中，加入不同濃度的IBA時(shí)，當(dāng)歸愈傷組織的增殖量普遍較多，其中0.3 mg·L-1、0.5 mg·L-1與1.0 mg·L-1IBA培養(yǎng)獲得的愈傷量差異不大，呈黃白色疏松顆粒，且生長狀況良好，同時(shí)也分化形成了少量的胚狀體。因此，0.5 mg·L-1和1.0 mg·L-1的IBA有利于當(dāng)歸愈傷組織增殖。

3.7 KT和IBA對(duì)當(dāng)歸愈傷組織增殖和胚狀體分化的影響(見表8)

表8 KT和IBA對(duì)當(dāng)歸愈傷組織增殖和胚狀體分化的影響

由表8可知，在添加了0.2 mg·L-1KT的1/2 MS基本培養(yǎng)基中，同時(shí)添加不同濃度的IBA，當(dāng)歸愈傷組織的增殖量均很大，呈黃綠色疏松顆粒，生長狀態(tài)良好。由此說明，0.2 mg·L-1KT能夠進(jìn)一步促進(jìn)當(dāng)歸愈傷組織增殖，愈傷狀態(tài)良好，其中1/2 MS+KT 0.2 mg·L-1+IBA 2.0 mg·L-1培養(yǎng)基中愈傷量大，胚狀體的分化量相對(duì)其它處理較多。愈傷組織第6次之后的繼代和胚狀體分化培養(yǎng)基可采用1/2 MS+IBA 2 mg·L-1+KT 0.2 mg·L-1+3%蔗糖培養(yǎng)基，但胚狀體的分化量還有待進(jìn)一步提高。

4 結(jié)論與討論

4.1 適宜的種子滅菌方法

將采自岷縣的當(dāng)歸種子先用流水沖洗30 min后，置于濾紙上吸干水分，然后先用70%乙醇漂洗10 s，再用0.1%升汞滅菌5 min，最后用無菌水沖洗3遍，用無菌濾紙吸干種子表面的水分。當(dāng)歸種子表面附帶有很多霉菌，滅菌的難度很大。通過研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸種子無菌發(fā)芽要獲得成功，首先要選用大而干凈的種子，其次滅菌時(shí)要充分震蕩，將種子表面的菌滌蕩干凈。再次，滅菌時(shí)可采用升汞和酒精配合滅菌，才能取得良好的滅菌效果。

4.2 適宜的愈傷誘導(dǎo)外植體和培養(yǎng)基

胚軸適宜于誘導(dǎo)愈傷組織，子葉誘導(dǎo)效果普遍不好。將胚軸接種于MS+IBA 2 mg·L-1+KT 0.2 mg·L-1培養(yǎng)基中，放入人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為23℃，濕度70%，光照時(shí)間14 h·d-1，光照強(qiáng)度2 000 lx，培養(yǎng)30 d后可誘導(dǎo)獲得愈傷組織。

4.3 適宜的愈傷組織繼代和胚狀體分化培養(yǎng)基

愈傷組織第1～5次的繼代及胚狀體分化培養(yǎng)基可采用1/2 MS+IBA 2 mg·L-1+3%蔗糖，愈傷組織第6次之后的繼代和胚狀體分化培養(yǎng)基可采用1/2 MS+IBA 2 mg·L-1+KT 0.2 mg·L-1+3%蔗糖培養(yǎng)基，愈傷組織生長良好，但胚狀體的分化量還有待進(jìn)一步提高。不同的繼代程序分化情況不同，在b-a-a-a的繼代流程中分化出完整的胚狀體，在b-b-b-b的繼代流程中僅分化出芽端，在艾鵬飛的論文中也有類似現(xiàn)象[9]，其原因可能是培養(yǎng)基中高濃度的無機(jī)鹽抑制了根的誘導(dǎo)。

4.4 胚性愈傷組織誘導(dǎo)

研究表明植物胚性愈傷組織的誘導(dǎo)生長素是必不可少的，而且多數(shù)植物誘導(dǎo)胚性細(xì)胞均采用2，4-D，目前的研究發(fā)現(xiàn)2，4-D對(duì)人體有毒害作用，應(yīng)避免使用[8]。已報(bào)道的有關(guān)當(dāng)歸組織培養(yǎng)均是采用2，4-D誘導(dǎo)獲得胚性愈傷組織。研究表明植物也可以采用無毒副作用的生長素IBA誘導(dǎo)獲得胚性愈傷并分化出胚狀體[10]。本研究探索采用IBA誘導(dǎo)當(dāng)歸的胚性愈傷組織，并取得了良好的效果。關(guān)于IBA誘導(dǎo)胚性愈傷組織的條件和發(fā)生機(jī)制還有待更加深入的研究。

4.5本研究從種子無菌發(fā)芽到愈傷誘導(dǎo)和增殖及胚狀體的分化，直至再生植株，建立了較為完善的當(dāng)歸組織培養(yǎng)技術(shù)體系，該技術(shù)體系流程簡單，可操作性強(qiáng)，為當(dāng)歸工廠化育苗和轉(zhuǎn)基因育種奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。本研究在當(dāng)歸組培中首次采用了無毒副作用的生長素IBA誘導(dǎo)獲得愈傷組織，誘導(dǎo)率高達(dá)100%，愈傷組織繼代15個(gè)月后仍保持旺盛的增殖速度(見圖d)，在1～5代的繼代中胚狀體的分化量很大，但6代之后胚狀體的分化量還有待進(jìn)一步提高。此外，本研究誘導(dǎo)獲得的疏松顆粒狀的愈傷組織增殖速度很快，非常適合于大規(guī)模細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，目前課題組正在開展相關(guān)研究。

圖d 15次繼代后仍旺盛生長的愈傷

[1] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 肖培根，楊世林，湯飛宇，等.藥用動(dòng)植物種養(yǎng)加工技術(shù)-當(dāng)歸[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2001.

[3] 顧靜文.當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv)Diels.組織培養(yǎng)研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1982，17(2)：131-137.

[4] 張世瑜，鄭國昌.當(dāng)歸愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生[J].植物學(xué)報(bào)，1982，24(6)：512-518.

[5] Huang H L，Chen C C，Chen U C，et al.Studies on tissue cultue ofAngelicasinensis(Oliv)Diels.I.Induction and growth of embryogenesis callus from immature embryo [J].J Agric Res China 1996，45：156-163.

[6] 雒曉芳，楊寧，陳學(xué)林，等.當(dāng)歸水培苗的組織培養(yǎng)[J].西北師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，40(4)：77-79.

[7] 左利娟，石進(jìn)朝.當(dāng)歸組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，4(1)：171-173.

[8] 劉蕊，李德紅，李玲.2，4-二氯苯氧乙酸的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究.2004(4)：71-75.

[9] 艾鵬飛.部分柿屬植物種質(zhì)資源離體保存及其遺傳穩(wěn)定性研究[D].2003.

[10] 王蒂.植物組織培養(yǎng)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社.2004.

StudyonCallusInductionandPlantRegenerationofAngelicasinensis(Oliv.)Diels

GAOSufang，ZHANGYanhong*

(DepartmentofPharmacy，GansuCollegeofTraditionalChineseMedicine，Lanzhou730000，China)

Objective：To explore the condition of callus induction and proliferation，the embryoid differentiation and plant regeneration，which are the groundwork for factory nursery and transfer-gene breeding ofAngelicasinensis(Oliv.)Diels.MethodsHypocotyl and cotyledon as explants，1/2 MS or MS as basal medium，added different kinds and concentration of phytohormone，which were in order to induce callus.Effects of different subculture ways and concentration of ABA，IBA and sucrose on callus proliferation and differentiation of embryoid were studied.ResultsThe appropriate callus induction medium was MS+IBA 2 mg·L-1+KT 0.2 mg·L-1.The subculture medium of callus and embryoid from first to fifth generation differentiation medium was 1/2 MS+IBA 2 mg·L-1+3% sucrose.After sixth generation the subculture medium of callus embryoid differentiation medium is 1/2 MS+IBA mg·L-1+KT 0.2 mg·L-1+3% sucrose.ConclusionA good technology ofA.sinensisplant regeneration via embryoid way had been established.

Angelicasinensis(Oliv.)Diels；Callus；Primary culture；Subculture culture；Embryoid；Plant regeneration

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.05.004

2014-02-08)