孫洪濤，孔凡芝，高津福

(1.江蘇大學附屬人民醫(yī)院，江蘇鎮(zhèn)江 212002;2.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院，天津 300052)

吸煙是導致牙周病的重要危險因素之一。尼古丁是香煙煙霧中的主要成分，約占煙草生物堿總量的95%以上。有實驗表明，尼古丁和煙草浸提液可抑制人牙齦成纖維細胞(human gingival fibroblasts，HGFs)的生長及貼附;HGFs可通過分泌大量的細胞因子，調節(jié)細胞的移動、增殖、分化和產(chǎn)生基質成分，在維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中發(fā)揮作用;細胞因子中的白介素－8(interleukin－8，IL－8)作為一種重要的炎性介質，可直接或通過誘導其他因子參與牙槽骨吸收、膠原酶產(chǎn)生、趨化炎性細胞聚集等一系列可造成組織破壞的炎性反應，從而導致牙周組織破壞，促進牙周病的發(fā)展［1］。本實驗通過觀察不同濃度尼古丁刺激對HGFs增殖、分泌IL－8的影響，探討尼古丁在牙周炎致病機制中的可能作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料

高糖 DMEM培養(yǎng)基(GiBico，美國);胎牛血清、DMSO、MTT、ELISA試劑盒(天津灝洋生物制品科技有限公司);尼古丁(Wako，日本)。

1.2 方法

1.2.1 人牙齦成纖維細胞(HGFs)培養(yǎng)

選擇因正畸治療需拔牙且牙齦健康的志愿者(知情同意)，并于拔牙時切取其少量牙齦組織;按組織塊培養(yǎng)法［2］，用含200 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、50 mL/L CO2、95%濕度條件下培養(yǎng)HGFs。

1.2.2 不同濃度尼古丁對HGFs增殖活性影響的觀察

取生長良好的第4代HGFs，制成密度為1×104/mL的單細胞懸液，并以每孔200 μL接種于96孔板，置于37℃，50 mL/L CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)24 h待細胞同步化后，吸棄培養(yǎng)液和未貼壁細胞，并將細胞隨機分為8組，分別加入含尼古丁濃度為 0 μg/mL(陰性對照組)、10、50、100、250、500、1000、2000 μg/mL 的含 FBS 的高糖DMEM培養(yǎng)基(每孔200 μL)繼續(xù)培養(yǎng)。

分別于培養(yǎng)第24、48、72 h各時間點取各組細胞(每組5孔)，按MTT試劑盒說明進行相應處理后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測各孔530 nm波長的OD值;并按以下公式計算各組細胞的生長抑制率:抑制率(%)=(未加尼古丁組OD值－加入尼古丁組OD值/未加尼古丁組OD值)×100%。

1.2.3 不同濃度尼古丁對HGFs分泌IL－8影響的觀察

取生長良好的第4代HGFs，制成密度為1×104/mL的單細胞懸液，并以每孔200 μL接種于96孔板，置于37℃，50 mL/L CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。常規(guī)培養(yǎng)24 h待細胞同步化后，吸棄培養(yǎng)液和未貼壁細胞，并將細胞隨機分為8組，分別加入含尼古丁濃度為 0 μg/mL(陰性對照組)、10、50、100、250、500、1000 μg/mL 的含 FBS 的高糖DMEM培養(yǎng)基(每孔200 μL)繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后，收集各組細胞培養(yǎng)上清(每組5孔)，按試劑盒說明用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測培養(yǎng)上清中的IL－8含量。首先用酶標儀測各孔540 nm波長的OD值，并以S/S0值(S=標準品或樣本的OD值，S0=標準品0點OD值)為縱坐標，以標準品的濃度為橫坐標，在對數(shù)坐標紙上繪制標準曲線;然后根據(jù)樣本的吸光度值即可在標準曲線中查得相應IL－8的濃度值(pg/mL)。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 不同濃度尼古丁對HGFs增殖活性的影響

不同濃度(2000、1000、500、250、100、50、10 μg/mL)的尼古丁分別作用于 HGFs 24、48、72 h不同時間后，均能抑制HGFs的生長，各時間點各濃度尼古丁對HGFs生長的抑制率分別與正常對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而且各濃度尼古丁對HGFs生長的抑制率均隨培養(yǎng)時間而逐漸增加，即呈時間依賴性;各時間點內(nèi)，尼古丁對HGFs生長的抑制率均隨其濃度增加而逐漸增加，即呈濃度依賴性(表1)。

表1 不同濃度尼古丁作用HGFs 3 d后的OD值()

表1 不同濃度尼古丁作用HGFs 3 d后的OD值()

濃度(μg/mL) 作用時間(h)24 48 720 0.5510 ±0.0076 0.5334 ±0.0054 0.4244 ±0.005410 0.5270 ±0.0087 0.4830 ±0.0089 0.3736 ±0.004550 0.5178 ±0.0086 0.4552 ±0.0115 0.3572 ±0.0077100 0.5022 ±0.0038 0.4368 ±0.0079 0.3382 ±0.0053250 0.4876 ±0.0112 0.4120 ±0.0073 0.3178 ±0.0068500 0.4610 ±0.0080 0.3966 ±0.0111 0.3018 ±0.00891000 0.4316 ±0.0067 0.3514 ±0.0076 0.2352 ±0.00332000 0.4118 ±0.0090 0.3226 ±0.0179 0.2094 ±0.0086

2.2 不同濃度尼古丁對HGFs分泌IL－8的影響

ELISA 檢測顯示，HGFs 在 500、250、100、50、10 μg/mL尼古丁作用下，其合成IL－8的量均明顯高于正常對照組(P＜0.05)，其中100 μg/mL尼古丁組合成IL－8的量最高;1000 μg/mL尼古丁組對HGFs合成IL－8的影響不明顯，與對照組相比無統(tǒng)計學差異(P ＞0.05)(表2)。

表2 不同濃度尼古丁對HGFs合成IL－8影響的比較()

表2 不同濃度尼古丁對HGFs合成IL－8影響的比較()

* 與0 μg/mL 相比 P ＜0.05

尼古丁濃度(μg/mL) IL－8含量(pg/mL)052.58 ±3.8410 144.79 ±6.48*50 151.84 ±5.98*100 181.27 ±3.70*250 138.30 ±3.58*500 95.90 ±2.15*1000 58.06 ±3.58

3 討論

牙周病變時，由于牙齦上皮受損，細胞間隙增寬，外界的細菌、毒素等有害物質可直接作用于牙周結締組織，影響其生長代謝和向牙根面的附著。牙齦成纖維細胞作為牙齦固有層的主要細胞，不僅具有活躍的自身更新能力，還可在細菌、毒素等有害物質刺激下分泌多種細胞因子及炎性介質。有研究發(fā)現(xiàn)，尼古丁作為香煙煙霧中的主要成分，不僅影響結締組織細胞如成纖維細胞的細胞形態(tài)、附著和蛋白質的合成、分泌，還影響成纖維細胞分泌多種細胞因子及炎性介質［3］。故本實驗采用尼古丁作為刺激源刺激體外培養(yǎng)的人牙齦成纖維細胞，觀察其增殖及IL－8表達的變化，以期探討吸煙對牙周病發(fā)生發(fā)展影響的作用機制。

本實驗結果顯示，在沒有尼古丁作用的情況下，HGFs表達IL－8的量較少;而在一定濃度范圍(10 ～500 μg/mL)尼古丁刺激下，HGFs分泌 IL－8的量明顯增多，其中以100 μg/mL時最高，此后逐漸降低。當尼古丁濃度達到1000 μg/mL時，對HGFs合成IL－8的影響不明顯(與對照組相比無統(tǒng)計學差異)。IL－8作為人體內(nèi)的一種細胞因子具有廣泛的生物學作用，可通過聚集和激活中性粒細胞而促進牙周組織破壞。另外，IL－8作為一種重要的炎性細胞因子，不僅能促進牙槽骨的吸收，同時還能抑制牙周膜的修復和代謝功能，并促進其他炎癥介質的釋放，從而影響牙周組織的改建、加重局部牙周組織的炎癥反應，導致牙周病的發(fā)生、發(fā)展［4］。據(jù)相關文獻報道，尼古丁可促進口腔表皮樣癌細胞株分泌 IL－8［5］;IL－1、TNF 均能刺激牙齦成纖維細胞產(chǎn)生IL－8，IL－8除能激活人外周血中性粒細胞外，還可與IL－1、TNF及其他炎癥介質協(xié)同發(fā)揮作用，從而介導中性粒細胞在炎癥部位的聚集［6］。Iho等［7］發(fā)現(xiàn)，尼古丁作用于中性粒細胞后，可使其IL－8表達量增加，且在一定濃度范圍內(nèi)呈時間和濃度依賴性。Giannopoulou等［8］利用實驗性牙齦炎模型進行研究發(fā)現(xiàn)，吸煙者與非吸煙者相比，其齦溝液中的IL－8表達量明顯增加。Wendell等［9］發(fā)現(xiàn)，尼古丁可促進人牙齦成纖維細胞分泌 IL－8。Bendre 等［10］報道，在牙周組織局部，IL－8除具有趨化中性粒細胞的作用外，還可間接刺激成骨細胞產(chǎn)生破骨細胞因子(RANKL)并刺激破骨細胞前體細胞的分化。本實驗進一步證實，10～500 μg/mL濃度范圍內(nèi)的尼古丁可促進牙齦成纖維細胞分泌IL－8，與上述結果基本一致;提示，尼古丁可通過刺激牙齦成纖維細胞導致炎性細胞因子的分泌，從而發(fā)揮免疫調節(jié)作用。但本實驗中當尼古丁濃度為1000 μg/mL時，對HGFs合成IL－8的影響不明顯，可能與尼古丁對細胞的毒性有關。因為在尼古丁濃度過高的情況下，人牙齦成纖維細胞膜被破壞，使細胞蛋白成分減少，并影響細胞微管和波形蛋白細胞骨架，從而影響細胞分泌IL－8。

綜上所述，一定濃度范圍的尼古丁對體外人牙齦成纖維細胞的增殖及其分泌IL－8能力均有明顯的影響，但其作用機制還需進一步研究。

［1］徐燕，袁萍，李頌，等.尼古丁和煙草浸提液對人牙齦成纖維細胞生長和貼附能力的影響［J］.口腔醫(yī)學研究，2004，20(1):16－18.

［2］司徒鎮(zhèn)強，吳軍正.細胞培養(yǎng)［M］.西安:世界圖書出版社，2007:58－59.

［3］Peacock ME，Sutherland DE，Schuster GS，et al.The effect of nicotine on reproduction and attachment of human gingival fibroblasts in vitro［J］.J Periodontol，1993，64(7):658 －665.

［4］Scarel－Caminaga RM，Kim YJ，Viana AC，et al.Haplotypes in the interleukin8 gene and their association with chronic periodontitis susceptibility［J］.Biochem Genet，201l，49(5 －6):292 －302.

［5］Cheng YA，Shiue LF，Yu HS，et al.Interleukin－8 secretion by cultured oral epidermoid carcinoma cells induced with nicotine and/or arecoline treatments［J］.Kaohsiung J Med Sci，2000，16(3):126－133.

［6］Bloemen V，Schoenmaker T，de Vries TJ，et al.IL－1β favors osteoclastogenesis via supporting human periodontal ligament fibroblasts［J］.J Cell Biochem，2011，112(7):1890 －1897.

［7］Iho S，Tanaka Y，Takauji R ，et al.Nicotine induces human neutrophils to produce IL－8 through the generation of peroxynitrite and subsequent activation of NF－kappaB［J］.J Leukoc Biol，2003，74(5):942 －951.

［8］Giannopoulou C，Cappuyns I，Mombelli A.Effect of smoking on gingival crevicular fluid cytokine profile during experimental gingivitis［J］.J Clin Periodontol，2003，30(11):996 － 1002.

［9］Wendell KJ，Stein SH.Regulation of cytokine production in human gingival fibroblasts following treatment with nicotine and lipopolysaccharide［J］.J Periodontol，2001，72(8):1038 －1044.

［10］Bendre MS，Montague DC，Peery T，et al.IL－8 stimulation of osteoclastogenesis and bone resorption is a mechanism for the increased osteolysis of metastatic bone diseae［J］.Bone，2003，33(1):28－37.